2018 Fiscal Year Annual Research Report
Activation mechanism of ubiquitin ligase parkin by PINK1 and phosphorylated ubiquitin
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15H04342
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
菅瀬 謙治 京都大学, 工学研究科, 准教授 (00300822)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 分子認識 / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NMR測定用の13C,15N標識rat parkinとhuman parkinの大量発現を試みている。LB培地では可溶性画分に発現されるのだが、安定同位体標識試料用のM9培地では常に不溶性画分に発現されて問題となっていた。様々な発現タグも試したが可用性画分に目的タンパク質を得ることができなかった。そのため、不溶性画分からの抽出およびリフォールディングを試したところ、活性をもったparkinが少量ではあるが得られることが分かった。そこで、まずは収量を上げるために、様々、条件検討を行った。その結果、まず、human parkinのUBLドメインを欠損させたRORBR領域（ドミナントアクティブ体）にHis6-SUMOタグを付加したものが最もよいコンストラクトであった。このコンストラクトの発現ベクターを用いて、37℃でタンパク質発現させると最も収量が高かった。リフォールディングについては、4M尿素でタンパク質を可溶化し、アルギニンやZnCl2（parkinはZnフィンガードメインを持つ）を加えたバッファーから透析で尿素を段階的に除去した。得られたparkinには自己ユビキチン化活性を持ち、さらにそのNMRスペクトルを測定することができた。ただし、リフォールディング後に切断したSUMOが非共有結合でparkinと会合し、これがまだ除去しきれていなかった。そのため得られたNMRスペクトルにはSUMO由来のシグナルが混入していた。parkinと比較してSUMOの方が分子量が小さいため、SUMO由来のシグナルのほうがより強く観測されてしまった。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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