2015 Fiscal Year Annual Research Report
P型ポンプ；エネルギー共役の分子基盤と異常による発癌
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15H04346
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
鈴木 裕 旭川医科大学, 医学部, 教授 (50183421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90207267)
山崎 和生 旭川医科大学, 医学部, 講師 (60241428)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Ca-ATPase / Ca-pump / mutations / kinetics / Structure and Function / tumor |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．小胞体Caポンプの輸送路開口・閉口機構とそれによる細胞質および小胞体内腔Ca2+濃度設定の仕組みを解明しエネルギー共役機構の理解をさらに深めるため、輸送の鍵となるリン酸化中間体異性化とそれに伴う小胞体内腔へのCa2+放出の構造的仕組みを、部位特異的変異と速度論的解析により研究した。その結果、触媒部位を構成する3つの細胞質ドメインの動きとドメイン間相互作用形成が逐次的に生起し、それに共役して内腔側への放出路開口と親和性低下が逐次的に生起しCa放出が起こることが分かった。この研究のため、内腔側に開口した輸送部位に結合したCa2+を捕捉する技術を開発できたことも大きな成果である。
２．触媒反応に伴う3つの細胞質ドメインの動きを輸送部位に伝えるために主要な役割を担う第2膜貫通へリックス（M2）について、輸送の各素過程特異的に、および構造領域特異的にM2が機能することを明らかにし、さらにM2細胞質側領域と膜貫通領域の連結部分の構造的重要性を見出した。上記１．の成果と共に、構造変化を介したエネルギー共役の仕組みの理解を深めた。
３．Caポンプ作動時の1分子動態を実際に解析するために特異的蛍光標識したCaポンプ1分子を組み込んだナノディスクを形成・精製することに成功し、さらに顕微鏡下で1分子蛍光観察に成功した。
４．SERCA2b遺伝子の4か所の点変異それぞれが発癌原因となること、表現型にはそれぞれで顕著な差がある事を見出し、さらに、詳細な個体解析を進めて論文にまとめた。なお、各変異のポンプ蛋白への影響を解析し発癌機序と病態差異を分子レベルで理解するため、各変異体を培養動物細胞にて発現し機能解析を実施する実験系を作成し解析を開始している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Ca2+輸送におけるエネルギー共役機構の構造的仕組みについて、計画した部位特異的変異と速度論的解析、およびCa2+の結合・遊離解析により、研究を進め格段に理解を深めることができた。特に、細胞質ドメイン間の逐次的な相互作用の生起とそれに共役した輸送部位の逐次的変化によるCa2+輸送プロセス、また共役による放出路と開口と閉口におけるM2の構造変化（αヘッリクス構造の部分的崩壊と巻戻し、それに伴う長さの変化）など本質的な構造的仕組みを明らかにできたことも極めて重要な知見である。これらの成果は、結晶構造で予想された構造的仕組みを支持しさらに発展させるのみならず、結晶構造からは予想できない本質的仕組みを明らかにするものである。他方、実際に作動するCaポンプの１分子ダイナミクスを解析するための戦略、すなわち注目した部位への特異的蛍光ラベル導入、1分子を組み込んだナノディスク形成、そして蛍光顕微鏡による観察の成功は、今後の展開を確実にする成果であり、研究の計画を大きく進捗させた。このように本申請研究は、確実に進捗している。
また、ENU-mutagenesisによるマウスモデル網羅的変異導入により、SERCA2b遺伝子の4か所の点変異が発癌原因となる事、しかも表現型には顕著な差がある事を見出していたが、当該年度に個体の詳細な病態解析を成果として論文に纏め上げることができ、今後、発癌機序と病態差異理解に必須の分子レベルの情報が得るための各変異のポンプ蛋白への影響を解明することの重要性を提示できた。そしてそのための実験系を立ち上げ着手できた。このようにこの計画についても確実に進捗させることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．Ca2+輸送におけるエネルギー共役機構（部位特異的変異と速度論的研究）：M2の細胞質領域と膜貫通領域の連結部分の構造的意義（へリックス構造や柔軟性など）を、各種部位特異的置換とそれら変異体の速度論的解析、Ca2+結合・遊離解析、および構造解析を行なって解明し、ドメインの動きを含む構造変化を介した細胞質領域と膜貫通領域（輸送部位）の相互応答機構を理解する。他方、E1PCa2安定アナログの開発、構造・機能特性、結晶構造解明：E1PCa2を捕捉する化学修飾を利用し、本中間体の安定構造アナログ（E1Ca2BeF3-）を形成し、構造・機能特性を解析すると共に、結晶化可能にするための安定化因子を検索し結晶構造解明に資する。そしてこれまで結晶化が困難であった本中間体の原子レベルの構造解明を可能とし、輸送機構の分子機序理解をさらに進める。
３．1分子ダイナミクス：によるポンプ作動時の1分子動態観察のため、特異的蛍光標識法精査、ナノディスク利用を含めた観察面への固定技術精査・開発、動態および機能解析装置の改良を行ない、解析を実施する。他方、ナノディスクを利用してCa2+ポンプ蛋白と脂質相互作用の解析によるCa2+輸送および速度における脂質の役割について解析を進め、1分子解析にも資する。
４．P型ATPaseメンバーの機能及び作動機構解明：フリッパーゼおよびCu-ATPase（銅イオン輸送体）の機能解析のための発現・精製系を確立して機能解析を行ない、これらの作動機構を解明する。
５．SERCA2b遺伝子変異による発癌：変異を有する当該蛋白の発現と機能への影響解析を行ない、発癌機序と各変異で大きく異なる病態発症機序理解のための分子基盤を確立する。
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[Journal Article] Novel allelic mutations in murine Serca2 induce differential development of squamous cell tumors2016
Author(s)
Hideaki Toki, Osamu Minowa, Maki Inoue, Hiromi Motegi, Yuko Karashima, Ami Ikeda, Hideki Kaneda, Yoshiyuki Sakuraba, Yuriko Saiki, Shigeharu Wakana, Hiroshi Suzuki, Yoichi Gondo, Toshihiko Shiroishi, and Tetsuo Noda
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Research Communications
Volume: 476
Pages: 175-182
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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