2015 Fiscal Year Annual Research Report
架橋酵素による自然免疫の応答制御と腸内細菌の維持機構
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15H04353
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
川畑 俊一郎 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90183037)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 腸内細菌 / 共生細菌 / シンビオシス / ディスビオシス / 抗菌ペプチド / 活性酸素 / トランスグルタミナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ショウジョウバエの腸管には、10～50種、約500万個の腸内細菌が常在しており、宿主の自然免疫系により管理されているが、腸内細菌に対する宿主の免疫寛容の分子機構には不明な点が多い。当研究室では、トランスグルタミナーゼ（TG）が翅や腹部といった外骨格の形成に関与するとともに、腸内細菌に対する免疫応答の制御を担っていることを見出した。タンパク質間の架橋反応は、皮膚の角質化や血液凝固など哺乳類にとって必須の反応である。この反応はTGが触媒しており、リジン残基とグルタミン残基の側鎖をイソペプチド結合で架橋する。哺乳類には8 種の TGアイソザイムが存在するが、ハエTGは1種のTG遺伝子でコードされており、TGの機能解析には優れたモデル系である。
ハエを用いた実験から、TGの架橋反応が腸管の抗菌ペプチド産生経路（IMD経路）のNF-κB様転写因子（Relish）を不活性化させることが判明した。すなわち、腸管上皮のTGは、抗菌ペプチド産生を担う転写因子を阻害することで腸内細菌に対する過剰な免疫応答を抑制し、宿主と腸内細菌の共生成立に関与していると考えられる。また、ハエTGは、哺乳類腸管のムチン層に相当する囲食膜の形成を促し、腸管内の微生物に対する防御を担っている。さらに、16S rDNA配列解析により、腸内細菌の同定を行ったところ、野生型ハエとTGをノックダウンしたハエでは腸内細菌叢が大きく異なっていた。
一方、ハエTG遺伝子は選択的スプライシングにより、TG-AとTG-Bの2種のアイソザイムを産生していた。TG-A、TG-BともにN-末端の分泌シグナル配列はなく、TG-Bはサイトソルに主に局在するが、TG-Aは2種類の脂質修飾を受けて細胞膜に輸送され、刺激に応答して分泌されることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今回の16S rDNA配列解析により、腸内細菌の同定を行ったところ、野生型ハエとTGをノックダウンしたハエでは腸内細菌叢が大きく異なっていることを明らかにするとともに、４種類の腸内細菌を同定した。４種類の内訳は、２種類が酢酸菌に属し、残りが、乳酸菌およびプロビデンシア菌の属していることが判明し、それぞれの菌株をSK1,SK2,SK3、SK4と命名した。さらに、各単離菌の抗菌ペプチドや活性酸素に対する性質を詳細に解析することができた。また、単離した菌を無菌バエの腸管に感染させたノトバイオートハエを作成して、生存率に与える影響を調べた。その結果、SK1とSK4を同時に感染させると生存率が減少することが判明した。
一方、ハエTG遺伝子は選択的スプライシングにより、TG-AとTG-Bの2種のアイソザイムを産生していた。TG-A、TG-BともにN-末端の分泌シグナル配列はなく、TG-Bはサイトソルに主に局在するが、TG-Aは2種類の脂質修飾を受けて細胞膜に輸送され、刺激に応答して分泌されることが明らかとなった。TG-Aの細胞膜への局在化は、N-ミリストイル転移酵素のRNAiや、N-ミリストイル化修飾の標的となるGly残基に変異を加えることにより抑えられた。さらに、ヨトウガの無細胞発現系およびミリスチン酸アナログを用いたクリックケミストリーによる解析を行ったところ、TG-AにのみN-ミリストイル化修飾が起こることが明らかとなった。加えて、ミリスチン酸アナログの経口投与により、生体内においてもTGはN-ミリストイル化を受けることが判明した。
以上の結果は、予定していた実験計画を十分に遂行できた結果であり、また原著論文として現在投稿中である。したがって、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、TG-RNAiで誘導される抗菌ペプチド産生とROS産生系の分子機構の関係を解明する。腸内でのROSの発生が全身性の免疫を誘導することが報告されているが、TG-RNAiにより、ウラシル分泌性の細菌が腸内細菌叢の主要細菌として置き換わることが判明すれば、TG-RNAiによる生存率低下の原因は、ウラシル分泌により惹起される宿主由来の過剰なROSである可能性が高い。そこで、TG-RNAiの腸管でのROS活性を定量するとともに、ROSに反応性の蛍光色素を用いて組織染色を行う。ROS産生は、細胞内のCa2+濃度の上昇につれて増大するが、一方、Ca2+濃度上昇の結果、TG活性が増強されて抗菌ペプチド産生は阻害されるはずである。TG-RNAi後のROS産生の経時変化を詳細に定量して、抗菌ペプチドの経時変化との相関性を調べる。
一方では、囲食膜形成に関わるTGの構造と機能解明する。囲食膜のTG基質として同定したドロソクリスタリンやペリトロフィン15bをノックダウンして、囲食膜形成におよぼす影響を顕微鏡観察により調べるとともに、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）や昆虫に対する強毒性菌であるP. entomophilaを経口投与して生存率を野生型と比較する。
これまでの予備実験により、緑膿菌やP. entomophilaの培地中に毒素成分（プロテアーゼ群）が存在することが判明している。そこで、毒素成分の精製タンパク質、あるいは組換え体を調製して経口投与し、TG基質のノックダウンハエに対する生存率を野生型と比較する。野生型では、TGによりドロソクリスタリンやペリトロフィン15bが架橋され、囲食膜を強固にしている可能性が推定される。そこで、ドロソクリスタリンやペリトロフィン15bの架橋化体の毒素プロテアーゼに対する感受性を調べる。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] Crosslinking of a peritrophic matrix protein protects gut epithelia from bacterial exotoxins.2015
Author(s)
Shibata, T., Maki, K., Hadano, J., Fujikawa, T., Kitazaki, K., Koshiba, T., and Kawabata, S.
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Journal Title
PLoS Pathogens
Volume: 11
Pages: e1005244
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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