2016 Fiscal Year Annual Research Report
高分解能変動電位透過観察技術の開発と液中生物試料の解析
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15H04365
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
小椋 俊彦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 上級主任研究員 (70371028)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 知子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 上級主任研究員 (30344146)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 誘電率 / 培養細胞 / 液中観察 / ナノスケールイメージング / 非染色 / 高コントラスト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、水溶液中の生きた細胞や細菌をナノレベルの高分解能で観察する新たな観察技術(高分解能変動電位透過観察法)を開発し、これを用いた様々な細胞の動的メカニズムを解明することである。本装置では、従来の走査電子顕微鏡(SEM)では観察が困難であった、水溶液中の非染色・非固定の生物サンプルをナノスケールの分解能で電子線のダメージが無く、高コントラストでの撮像することが可能となる。
本年度は、培養細胞を直接観察するための薄膜ホルダー付培養ディッシュを開発した。この培養ディッシュホルダーでは、培養細胞を直接窒化シリコン薄膜上に培養し、細胞がある程度増殖・伸展した時点で培養ディッシュから薄膜ホルダーを取り外し、誘電率観察用ホルダーに培養液を満たした状態で封入する構成とした。これにより、生きた状態で薄膜上の細胞を直接観察ホルダーへと封入することが可能となった。また、観察に適した細胞の選定も行い、共同研究者の樹立したマウス乳がん細胞が極めて窒化シリコン薄膜への張り付きが良く、さらに長時間安定して観察出来ることを見出した。これにより、細胞内の微細な構造を生きた状態で染色や固定化することなく観察することが可能となり、細胞内小器官の変化を捉えることに成功した。さらに、膜タンパク質のCD44に対する抗体とナノビーズを細胞に結合させ、ビーズと生きた細胞構造の同時観察を可能とした。こうした成果は、2本の国際論文として発表することが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生きたそのままの培養細胞の観察のためのホルダー開発を行い、多くの改良を行うことで、当初の目標であった非染色・非固定の生きた細胞観察に成功した。さらに、細胞の膜タンパク質に抗体を用いてナノビーズを結合させ、その直接観察を実現することが出来た。こうした成果は、生きたそのままの細胞のナノスケール観察だけでなく、観察された構造が何のタンパク質により構成されているかの同定を可能とした。ほぼ当初の予定や目標を達成する成果を達成したと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、培養細胞の観察ホルダーをより安定的に長期間の観察が可能な様に、ホルダー内部の圧力やCO2濃度を調整する機構や潅流を可能とする流路等を形成する。これにより、走査電子顕微鏡に設置した培養細胞をより活動的な状態で、その詳細な変化を高分解能で観察することを目指す。さらに、観察窓の周辺に細い流路を形成することで、観察を行いながら試薬やタンパク質等を細胞に投与し、その変化の解析を行う。こうした試薬としては、細胞を活性化するグルタミン酸等の情報伝達物質や膜タンパク質に結合する抗体等を予定している。この様な変化を捉えるためには、同一箇所複数回撮像する必要があるため、膨大な画像枚数となる。そのため、多数の撮像画像から自動的に変化分を解析・分析する画像情報処理アルゴリズムの開発も同時に進める。このアルゴリズムとしては、テンプレートを用いた差分からその変化分を求める方法や、Neural Networkによる画像認識処理等を応用する予定である。実際のソフトの構築では、科学技術用演算言語のMatlabや汎用のインタープリター言語のPythonにより開発を行う。加えて、検出システムの低ノイズ化と高利得化を行い、撮像時間の短縮を進める。現在、一枚の撮像に80秒程必要であるが、これを20秒以下にまで短縮し、より短時間の変化を捉えることを目標とする。
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