2016 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集技術応用によるシス制御因子駆動型進化メカニズムの実験検証
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15H04408
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
隅山 健太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, ユニットリーダー (00370114)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 進化 / ゲノム編集 / 発現制御 / 発生・分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度は以下項目の実験を進めた。
（１）ノックイン（KI)技術の改良とその応用によるシス因子の非コード領域への挿入実験および標的ツールキット遺伝子へのレポーター遺伝子挿入実験：KIの効率を高めるためTriple CRISPR法で開発した新しいsgRNAデザイン法を応用し、二重鎖DNA（プラスミド）を修復鋳型とするノックイン実験を行った。受精卵前核注入法によるlacZレポーター遺伝子のDlx3遺伝子への挿入実験では、約4kbの全長が正確に挿入された初代マウス個体を得ることが出来た。この個体の皮膚の一部を採取しlacZレポーター発現がDlx3の発現パターンを正確に反映していることが確認できた。現在系統化作業を行っている。その他、Dlx5-6遺伝子の鰓弓エンハンサーを修復鋳型とする、後述するDlx3-4クラスターCTCFアンカー領域周辺へのKI実験が進行中で、現在最初の産子が得られたところである。
（２）ツールキット遺伝子としてDlx3、Dlx4遺伝子を選定し、ノックアウト（KO）表現型を確認するため、Triple CRISPR法によるKOマウスを作製した。Dlx3ホモKOマウスは胎盤の形成不全による致死性を示し過去の報告と一致した。現在今後の活用のためヘテロ接合KOマウスを作製中である。一方Dlx4遺伝子ホモKOマウスは明らかな異常表現型を示さず、今後の詳細な解析が必要である。
（３）DLX3-4クラスター非コード領域について、ChIA-PET解析データからDlx3遺伝子と相互作用がある3候補領域についてエンハンサー活性解析を行い、そのうちの一つからDlx3遺伝子の発現パターンと一致する非常に強い鰓弓活性が発見された。この領域をパラログDlx56鰓弓エンハンサー（Dlx3より時期的に早く、より広範囲の活性がある）の挿入サイトとして有力視して現在ノックイン実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
エンハンサーノックイン・ノックアウトを作製する実験に関して、ノックアウト実験には問題が無く進行しているが、ssODNを使用したエンハンサーモチーフノックイン実験について、最初の産子のジェノタイピングを行ったところ当初想定していたノックイン効率が得られず、系統化に適したマウスを得るため条件を変更しインジェクション数も増やした再実験を行うこととなり、結果として数ヶ月程度の遅れが生じた。現在はノックイン効率が向上しその後の実験は問題無く進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）受精卵前核注入法によるlacZレポーター遺伝子のDlx3遺伝子への挿入実験で約4kbの全長が正確に挿入された初代マウス個体を得ることが出来たため、今後この個体の系統化を行い、エンハンサーノックイン・ノックアウトで生じる胎児の発現パターン異常の検出を容易にする実験系を構築する予定である。当初計画ではRNA発現パターンの解析のみであったが、このlacZレポーター系統の活用により効率的に解析を進めることが可能と見込まれるため、優先的に作業を行う。
また、Dlx5-6遺伝子の鰓弓エンハンサーを修復鋳型とするDlx3-4クラスターCTCFアンカー領域周辺へのノックイン実験について、得られた産子のタイピングを進め、系統化して表現型解析を行う。
（２）エンハンサーノックイン・アウトマウスとのヘテロコンパウンドマウス解析を行うため、ヘテロ接合Dlx3ノックアウトマウスを樹立する。また、Dlx4遺伝子ノックアウトマウスにどのような表現型があるか詳細に解析を進める。
（３）ChIA-PET解析データから新たに発見された鰓弓特異的エンハンサー活性について、トランスジェニックマウス解析を詳細に行って発現のステージや発現領域などを記述し、内在性Dlx3遺伝子発現パターン、あるいはDlx56遺伝子発現パターンとの類似性と相違性を明らかにし、今後のエンハンサーノックイン解析の比較対象データ基盤として確立する。
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