2015 Fiscal Year Annual Research Report
RubiscoのC4化によるイネの光合成能力の改良
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15H04443
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
深山 浩 神戸大学, 農学研究科, 助教 (60373255)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
谷口 洋二郎 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 作物研究所, 主任研究員 (50462560)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 光合成 / 二酸化炭素 / 酵素 / イネ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ソルガムRbcS高発現イネRbcSノックダウン2重形質転換イネで発現するRubiscoの酵素特性を解析した．2重形質転換イネのRubiscoは，ソルガムRbcSを高発現しただけの形質転換イネのRubiscoに比べて，触媒速度，CO2に対するKmが高くなることが明らかとなった．しかし，RNAi法によるノックダウンではRubisco含量を適度に調節することが困難であり，光合成速度を増加させることはできなかった．そこで，ソルガムRbcSを高発現する形質転換イネのイネRbcSをCRISPR/Cas9法によりノックアウトすることを試みている．
イネのRubisco活性を高めるのにソルガムRbcSよりも効果的なRbcSがあるのかを探索することも重要と考え，ソルガムと同様にC4植物であるギニアグラス，ネピアグラスからRbcSをクローニングし，イネへの遺伝子導入を行った．
これまで，日本型水稲品種「日本晴」を用いて形質転換イネを作成してきた．日印交雑品種であるタカナリ，モミロマンは多収であり，光合成能力も高いことが知られている．そこで，タカナリとモミロマンにソルガムRbcSを導入して，光合成能力への効果を明らかにすることは重要と考えられる．本年度は，タカナリとモミロマンへのソルガムRbcSの導入を行った．タカナリでは3系統，モミロマンでは多数のソルガムRbcSを高発現する形質転換イネが得られている．
RbcSがほぼ全てソルガムRbcSに置き換わった2重形質転換イネで発現するRubiscoを硫安分画，陰イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した．また硫酸イオン存在下で，ハンギング・ドロップ蒸気拡散法により結晶化を行い，X線結晶構造解析を進めている．2重形質転換イネだけでなく，非形質転換イネ，ソルガムについてもRubiscoの精製を行い，X線結晶構造解析を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1年目は新しい形質転換体の作出を多く計画していたが，計画はおおむね予定通りに進んでいる．計画当初はRubisco含量の調節にRNAi法を用いて，トリガー配列を工夫することにより，より効率よくRbcSをノックダウンすることを考えていた．しかし，現在，CRISPR/Cas9法がイネでも可能となったため，CRISPR/Cas9法によるイネRbcSのノックアウトを行うことに計画を変更した．
X線結晶構造解析に関しては，実験計画では2重形質転換イネで発現するRubiscoのみ行うつもりであったが，比較のために非形質転換イネやソルガムのRubiscoについても解析を行う必要があると考え，それらの構造解析についても進めている．それら全てについて結晶が得られており，構造の違いも明らかになりつつある．
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| Strategy for Future Research Activity |
計画通りに研究を進めていくつもりである．CRISPR/Cas9法によるイネRbcSのノックアウトが成功したら，同じコンストラクトをタカナリ，モミロマンにも導入する．得られた形質転換イネの光合成特性，Rubiscoの酵素特性を詳細に解析する．
イネRubiscoの触媒特性を増加させるのに効果的なRbcSの探索に関しては，現在，ギニアグラス，ネピアグラスのRbcSを検証しているが，余力があればこれらに加えて，トウモロコシ，エノコログサなど他のC4イネ科植物のRbcSについても解析に加えるつもりである．より多くの植物種のデータを比較することによって，触媒作用の決定に重要なアミノ酸残基の絞り込みの精度を高めたいと考えている．また，ソルガムRbcSよりも効果の高いRbcSが同定できれば，それを利用した光合成能力の改良についても進める予定である．
X線結晶構造解析については，引き続きRubiscoの精製，結晶化，構造解析を行い，データの精度を高める予定である．
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