イネにおけるセロトニン蓄積の抑制機構の解明：アブラムシによる抵抗性の抑制と利用

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04462
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 手林 慎一 高知大学, 教育研究部自然科学系農学部門, 准教授 (70325405)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 間世田 英明 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 上級主任研究員 (10372343) ; 及川 彰 山形大学, 農学部, 准教授 (50442934) ; 石原 亨 鳥取大学, 農学部, 教授 (80281103)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: イネ / 防御機構 / アブラムシ / セロトニン

Outline of Annual Research Achievements

オカボノアカアブラムシ(以下アブラムシ)がイネ根に寄生すると誘導抵抗性として褐変が生じる。ところが褐変物質の前駆体であるセロトニンの蓄積が不自然に遅延し、アブラムシの寄生後2～4日間は低い濃度にとどまる。低濃度のセロトニンがアブラムシの生育を促進することを確認したことから、アブラムシはイネの防御反応を抑制することで抵抗性を弱めるばかりか、さらにこの抵抗性物質を逆手にとり自身の増殖に積極的に利用している可能性が示唆された。本研究ではこのアブラムシによるイネの誘導抵抗性を制御する機構を分子生物学的・生物有機化学的に解明することを目的とした。H29年度はアブラムシがイネ根に寄生した際の、植物における植物ホルモン動態や遺伝子発現動態の網羅的な測定を継続するとともに、サリチル酸やアブシジン酸処理したイネ根での応答をも調査し、イネの反応を比較調査した。
現在まで判明していた、防御機構の前半部分、即ちアミノ酸の代謝経路の活性化によるセロトニン蓄積による化学的防御機構は、主にアブシシン酸の制御による、イネ根の応答反応であることがホルモン挙動とホルモン処理の予備試験から推定された。一方で後半部分の褐変化の制御は、同様の試験からサリチル酸により行われているものと推定された。以上のことから、イネ根において害虫加害に対する植物の応答はアブシシン酸による早期の応答と、サリチル酸による後期の応答が存在し、その二つの制御システムの切り替え時にセロトニンが蓄積し化学防御を展開していることが判明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

イネの芽生え（４日齢）に予め50uM SA若しくは1mM ABAを処理したイネ根約15-20 mgから破砕機(2200 rpm)とキット(RNeasy Plant Mini Kit)を用いてtotal-RNAの抽出・精製し、バイオアナラオザーを用いて純度の検討を行った。RIN値8.5以上のtotal-RNAを対象にキット(Affymetrix)を用いてcRNAを経てss-cDNAを合成し、短断片化した後にDNAマイクロアレイ(Affymetrix Rice(Jp) Gene Array 1.1 ST Strip)にハイブリダイゼーションさせ、マイクロアレイスキャナで読み取ることで遺伝子発現の網羅的な解析を達成した。既に解析したアブラムシ寄生時のイネの遺伝子発現動態との比較を行った。
また、病害抵抗性に関与する植物ホルモンのうちサリチル酸(SA)、サリチル酸グルコシド(SAG)、アブシジン酸(ABA)分析、ジャスモン酸(JA)、ジャスモン酸イソロイシン(JA-Ile)の分析条件は決定済みであったが、未明であったためオーキシン（IAA）のLC-MSMS(MRM)での分析条件の検討を行い最適化に至った。このことから今後イネ根におけるホルモン変動の経時的な解析が可能となった。
以上のことから本研究は概ね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

オカボノアカアブラムシがイネの根に寄生した際にどのようにセロトニンの蓄積を抑制させ、どのように自身の生存環境を改善しているかを解明するために、既に構築した研究協力体制により次の項目を実施し、セロトニン蓄積抑制の制御システム解明を目指す。
植物試料調整方法：イネ幼苗（日本晴）およびオカボノアカアブラムシを準備し、人工気象器にてアブラムシの寄生したイネ根を準備する。本年は得られた解析結果に基づき植物ホルモンや各種阻害剤で処理したイネの根を準備し各種測定の試料に供する。
マイクロアレイ解析：現在までにDNAマイクロアレイ法によるイネ根かにおける網羅的な遺伝子発現量の解析方法は確立している。本年は昨年度調整したABA処理イネ根の発現動態解析を完遂させ、これをもとにネットワーク解析を行う。既に、セロトニン蓄積はABAの制御により生じることが判明していることから、セロトニン蓄積の抑制はABAの制御もしくはIAAの制御によって行われている可能性が高い。よって、セロトニン生合成経路に関わる解糖系・TCA回路の代謝酵素に関する遺伝子の発現量と、それらの発現調節因子の動態に重点をおき、詳細な解析を行う予定である。
メタボローム解析：本年度は解析結果を裏付けるためにABAおよびSA処理を行ったイネ根を対象に、Agilent G3250AA LC/MSD TOF systemを用いて既に最適化されたCE-TOFMS分析を引き続き行う。これによりセロトニン蓄積の抑制機構を決定する。

Research Products

• [Journal Article] Induced accumulation of tyramine, serotonin, and related amines in response to Bipolaris sorokiniana infection in barley (2017)
  • Author(s): Atsushi Ishihara, Rie Kumeda, Noriko Hayashi, Yukari Yagi, NanaseSakaguchi, Yu Kokubo, Naoki Ube, Shin-ichi Tebayashi & Kotomi Ueno
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology and Biochemistry Volume: 81 Pages: 1090-1098
  • DOI: 10.1080/09168451.2017.1290520
  • Peer Reviewed / Open Access