2015 Fiscal Year Annual Research Report
ランタノイド依存メタノール脱水素酵素の多様性と制御機構の解明
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15H04476
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
谷 明生 岡山大学, その他部局等, 准教授 (00335621)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | メタノール / メチロトローフ / ランタノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メタン・メタノールを資化する微生物は地球上でのC1化合物の循環に大きな役割を持っている。中でもメタノール資化性細菌は植物が放出するメタノールを利用して生育し、中にはMethylobacterium属細菌の様に植物生育促進作用を持つものも存在する。メタノールの酸化に関わる酵素、メタノール脱水素酵素はこれまでカルシウム依存のMxaFという酵素が知られていたが、そのホモログ遺伝子XoxFは機能が分かっていなかった。近年になりXoxFがランタノイド元素を補因子とする酵素であることが発見され、本属細菌がMxaF, XoxFの金属に応答した発現をどのように制御しているのかは分かっていない。また、XoxFはMxaFよりも進化的に祖先型にあたり、MxaFよりも幅広い微生物が保持していることが分かっている。このことはメタノール資化性細菌というのはこれまで知られているより多く存在しており、ランタノイドが存在すればメタノールを利用できる、未知なる菌が多く存在していることを示唆している。本研究では本属細菌をモデルとしてMxaF, XoxFならびにそれらのホモログ遺伝子の機能解析及び金属要求性などを明らかにすることと、ランタノイド元素が存在すればC１化合物を利用できる細菌のスクリーニングを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．Methylobacterium属細菌をモデルとしたメタノール脱水素酵素(MDH)の解析
モデルとしたM. aquaticum 22A株にはMDHホモログが6つ存在する。これらの単一遺伝子破壊株、多重遺伝子破壊株を作製し、メタノール、エタノールなどの炭素源並びに金属を変更して培養試験を行った。その結果カルシウムに依存するMxaF、ランタノイドに依存するXoxFの遺伝子が同定できた。またこれら二つの遺伝子がメタノール、エタノールへの生育に必須であることが分かった。これ以外の遺伝子の破壊株の解析ではそれらの機能同定には至らなかったが、MxaF, XoxFが共に破壊されることで発現するプロパノール酸化酵素と考えられる酵素遺伝子が存在することが分かった。またXoxF単独でランタノイド存在下ではメタノールに生育するが、MxaF単独ではカルシウム存在下でもメタノールに生育出来ず、XoxFの存在が必要であった。このことはXoxFがMxaFの発現に必要であることを示唆していた。興味深いことに△XoxF株からカルシウム依存でメタノールに生育する突然変異株が得られ、ゲノムのリシーケンスの結果、MxaF, XoxFの発現調節に関わると考えられているMxbD遺伝子に変異が見つかった。
2. ランタノイド依存性メチロトロフの探索
上記の理由でランタノイドは通常微生物の培養には用いられないが、これを用いることでメタン・メタノールに生育する菌が得られる可能性がある。そこでメタンを単一炭素源としてランタノイド存在下でのみ生育するメタノトロフを探索した。得られたメタノトロフは既知のものであり、その生育がランタノイドに依存していなかったため、メタノール資化性細菌を探索した。その結果Methylophilus, Methylotenera, Pleomorphomonasに近縁な新属・新種細菌が見つかった。現在このゲノム解析を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．Methylobacterium属細菌をモデルとしたメタノール脱水素酵素(MDH)の解析
MxbDの変異においてMxaFの発現におけるXoxF依存性が解除されたことから、この変異株を中心に解析を進めることでMxaF, XoxFの金属に応答した発現調節機構が解析できると期待している。まず野生株のMxbDを破壊し、変異型MxbDを導入することで、突然変異株ゲノムに起こった様々な変異の中でMxbDの変異が重要であることをまず示す。また導入株のMxaFのXoxF依存性が解除されるかを検討する。一方でMxaF, XoxFの金属特異性を決定づけているアミノ酸残基を入れ替えた変異酵素を作製し、発現させ、酵素の金属要求性と、MxaF発現のXoxF依存性が変化するかどうかを検討する。次にMxbD（センサーキナーゼ）と共に二成分系をなすMxbM（制御タンパク質）のリン酸化状態の金属依存性と、MxaF, XoxFプロモーターへの結合を解析すれば、金属に応答した各遺伝子の発現調節機構が解明される。
2. ランタノイド依存性メチロトロフの探索
数百に上る分離株について、そのランタノイド依存的なメタノール資化性を検討したが、現在までにランタノイドに依存するものは数株のみ得られている。Methylobacterium属細菌のようにMxaF, XoxFの両方を持っていてランタノイドに完全に依存したものは少ないか、まだ何か未知の必須因子が存在するかもしれない。得られた株のほとんどは人工の培地で生育が弱いが、Pleomorphomonas属細菌は良く生育し、ゲノム解析の結果MxaF, XoxFの両方を持っていた。さらに窒素固定遺伝子も保持していた。イネの根圏を分離源としていたが、イネの内生菌としても検出されている報告もあることから、植物との親和性が高いと考えられる。そこで、接種によるイネの生育への影響を調べ、生長促進の有無を観察する。またGFPラベルなどを行い内生するかどうかも検討する。
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