Developement of useful enzymes from thermophilic viruses

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04490
• Research Institution: Osaka Institute of Technology
• Principal Investigator: 大島 敏久 大阪工業大学, 工学部, 教授 (10093345)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大森 勇門 大阪工業大学, 工学部, 講師 (90570838)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 好熱菌 / ウイルス / ゲノム解析 / 酵素 / 溶菌酵素 / 極限環境微生物

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度は本研究の実施2年目である。平成27年度において、様々な高温環境における土壌から好熱菌の分離をpH 8.0、60℃で行い、好アルカリ性好熱菌2株の分離に成功した。両者を16SｒDNAの塩基配列の相同性から、Bacillus themolactis、及びGeobacillus 　toebiiと同定した。本年度は両者を指示菌（宿主）とする好熱菌ウイルス（ファージ）の分離を、温泉などの高温環境から得た土壌サンプル(約75種類)を用いて行った。その結果、B. themolactis ではファージ感染による明確な溶菌班（プラーク）形成は得られなかったが、G. toebiiから明確なプラーク形成が認められ、好熱菌のファージを得ることに成功した。このファージφIN1の宿主感染性の特異性（感染域）を8種の異なる好熱菌を用いて調べた結果、特異的にG. toebiiにプラーク形成を認めた。またファージの耐熱性とｐH安定性をG. toebiiへの感染性から調べたところ、60℃までは認められたが、70℃では消失した。また、pH 5から9までの広いｐH 条件下でプラークが観察された。さらにpH 8では50－90℃で1時間ファージを処理しても生存することが確認でき，φIN1が新規耐熱性ファージであることを見いだした。一方、前年度に見いだした好熱菌G. kaostophilusを特異的に溶菌する酵素（耐熱性バクテリオシン)素について、その精製を各種クロマトグラフィ―を用いて検討し、電気泳動による分析から部分精製酵素を得ることに成功した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

自然環境からの分離した好熱菌を宿主とする新規な好熱好アルカリ性ファージφIN1の分離に成功した。このファージの電子顕微鏡による形態観察を試みたが、ファージの形態を明確にとらえた電顕写真を得るに至っていない。また、ファージの耐熱性やpH安定性は明らかにできたが、ファージ粒子の精製と遺伝子の取得が容易でなく、そのゲノムの塩基配列の決定が予定よりも遅れている。一方温泉水から得られる好熱菌G.　kaustophilusに溶菌活性を示す溶菌酵素をもつ好熱菌を発見したが、その溶菌酵素の高純度精製が容易でなく、特徴の解明が当初の計画よりもやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究としては、さらに新規好熱菌ファージの探索を行い、また好熱菌ファージの分離法の改善を図る。平成28年度までに見出した好熱菌のファージの純化を行うとともに、電子顕微鏡観察による形態的特徴を解析する。さらにファージ粒子の大量取得を行い、DNAシークエンサーを用いて、分離したファージのゲノムの解析を行う。そのゲノム情報を基に、ファージの分類・同定を行う。遺伝子の相同性検索からの酵素やタンパク質の遺伝子の機能同定を進める。その遺伝子の中から有用酵素遺伝子の大腸菌などを宿主としたクローニングを行い、遺伝子産物を生産・精製する。精製したタンパク質の機能を生化学的分析により同定するとともに，構造解析を行う。一方、平成28年度までに見出した好熱菌の溶菌現象についても、その詳細な特徴を明らかにしたいと考えている。特に溶菌活性を示す好熱菌の同定、溶菌スペクトルの分析、溶菌酵素の遺伝子クローニングによる組換え大腸菌での生産、簡便な精製法を確立し、その応用面への展開もはかるために生化学的特徴や構造の解析を行う予定である。