2017 Fiscal Year Annual Research Report
シガテラの発生機構解明を目指して－水深10m以深に発生する原因藻の生理・生態
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15H04535
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
足立 真佐雄 高知大学, 教育研究部自然科学系農学部門, 教授 (70274363)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大西 浩平 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (50211800)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | シガテラ / Gambierdiscus |
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| Outline of Annual Research Achievements |
次世代シーケンサーを用いた本属藻の網羅的群集組成の解明 まず、渦鞭毛藻に特異性が高いSSU rDNAのV8-V9領域に結合するプライマーセットを新たに開発した。これを用いて、沿岸海域より採取・調製した微細藻類画分を用いてSSU rDNAをPCR増幅させ、パイロシーケンスを行うことにより本属藻を含む付着性微細藻類の群集組成解析を行った。その結果、水深30 m付近の微細藻類群集と表層付近の微細藻群集は明確に異なること、水深30 m付近にはこれまで本邦沿岸域において見つかったことのないGambierdiscus属の種や、これまで国内外で見つかったことのない本属の新奇種が発生していることが明らかとなった。
各種環境条件(水温・塩分・光強度)が本属藻の増殖に及ぼす影響評価 深い水深より得られたG. silvae OHHG13株を、IMK/2培地中にて各種水温・塩分の培養系における増殖速度を求めた。その結果、本株は水温20-30℃,塩分25－40 PSUの条件下で増殖可能であり、特に水温20℃・塩分35 PSU、水温25℃・塩分30－35 PSUの各条件下にて良好に増殖することが明らかになった。また、本株は11.2～610 μmol photons/m2/sの範囲の光条件の下で増殖可能であった。さらに、増殖至適光強度(Im)と増殖好適光強度(Iopt)を求めた結果、それぞれ115 μmol photons/m2/sと46-299 μmol photons/m2/sとなった。
定量PCRによる本属の有毒各種を特異的に定量可能な手法の開発 深い深度に棲息するGambierdiscus silvaeに特異的なDNA配列を検索し、これに結合するプローブ・プライマーセットを設計した。さらに、これらを用いて、本属各種の遺伝子を定量するために必要となる直線性の高い検量線を作成に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度目標とした「次世代シーケンサーを用いた本属藻の網羅的群集組成の解明」と「各種環境条件(水温・塩分・光強度)が本属藻の増殖に及ぼす影響評価」の各項目については、順調に進展していると言える。また、「定量PCRによる本属の有毒各種を特異的に定量可能な手法の開発」については、プローブ・プライマーセットを開発し、検量線を作成することは出来たが、定量PCRの基礎となる1細胞あたりのコピー数の検討には至らなかったため、全体として概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
定量PCRによる本属の有毒各種を特異的に定量可能な手法の開発 前年度開発したGambierdiscus silvaeに特異的なプローブ・プライマーセットを用いて、定量PCRを行うことにより、試料に含まれる検出対象種の遺伝子量(x)を定量する。この際、各種の細胞数を正確に求めるために、試料に含まれる各種の遺伝子がどの程度回収されたか、つまりDNA回収率を明らかにすることが重要となる。この求め方として、既知量(a)のプラスミドをあらかじめ添加した試料からDNAを抽出した後に、プラスミドに反応するプローブ・プライマーセットを用いた定量PCR法によりこれを定量(b)し、添加前後のプラスミド量に基づきDNA回収率(=b/a)を求める。この回収率を用いて、先に求めた遺伝子量(x)を補正することにより、試料に元々含まれていた遺伝子量(xa/b)を推定する。また、現場海域より採取した細胞を単離し、この1細胞に含まれる遺伝子量(y)を上記した方法により求める。求めた細胞当たりの遺伝子量(y)により、試料に含まれる遺伝子量(xa/b)を割ることにより、試料に含まれる対象種の細胞数(xa/yb)を求める。
本属各種の現場動態と発生時の現場環境条件の解明 上記にて確立した定量PCR法を用いて、水深10 m～30 m層より2ヶ月に1回程度採取した現場試料に含まれる本属各種の発生量を求めることにより、それぞれの動態を解明する。同時に、それぞれの試料が採取された現場環境条件(水温、塩分、pH、光強度、窒素/リン濃度)について検討することにより、それぞれの種がどの様な環境条件の下で発生するのか、相関解析や多因子解析等の統計的手法を用いて解析する。
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Research Products
(6 results)
