2016 Fiscal Year Annual Research Report
バイオイメージング法によるテトロドトキシンと輸送タンパク質の動態解析
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15H04550
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
長島 裕二 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (40180484)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永井 慎 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 准教授 (30460497)
松本 拓也 県立広島大学, 生命環境学部, 助教 (30533400)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 水産学 / 生体分子 / テトロドトキシン / バイオイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、フグの毒化機構解明のため、１）放射性テトロドトキシン（TTX）を用いたSPECT/PETバイオイメージング法によるTTXの可視化検出法を確立し、２）TTXの体内輸送にかかわるタンパク質の特性と機能の解明を行い、３）フグ体内におけるTTXの動態を明らかにすることを目的としている。
１）放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージング法によるTTXの可視化では、これまで放射性TTXの合成について検討し、今年度は、TTXのタンパク質ドッキング分子配座に影響のない箇所に放射性物質を結合するため、分子力学計算した結果、ヨウ素またはテクネチウムが分子エネルギー的に最適であることを見出した。これら放射性物質を結合したTTX合成品は、マウス心筋細胞を用いたパッチクランプ法でナトリウムチャネルに対する結合親和性を保持することを確認した。
２）TTX輸送運搬タンパク質では、ヒガンフグ卵巣から単離したフグ毒結合タンパク質（ビテロゲニン類似タンパク質）の構造、性状ならびに機能を調べており、今年度は、ビテロゲニン類似タンパク質をコードするmRNAのヒガンフグにおける発現部位をRT-PCR法で調べ、雌の肝臓と卵巣で発現していることを明らかにした。さらに、ビテロゲニン類似タンパク質とTTXの結合活性を調べるため、フグと一般魚の卵からビテロゲニン類似タンパク質の精製に着手した。TTX取り込みトランスポーターに関しては、これまでにフグゲノムデータベースと次世代シーケンスアーカイブデータを利用して、遺伝子のスクリーニングを行ってきた。今年度は、TTXを輸送すると予想される有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTNをコードする推定塩基配列を抽出し、PCRにてトラフグの肝臓での発現を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージングについては、放射性TTX物質を有機合成するために、TTXに放射線ラベルする置換位置やラベル化する放射性元素の検討を計画し、ほぼ計画通り進行している。具体的には、TTXと高い結合親和性を示し、タンパク質構造が解明されているナトリウムチャネルをモデルにして、TTXのタンパク質ドッキング分子配座に影響のない箇所に放射性物質を結合するため分子力学計算を行った。その結果、ヨウ素またはテクネチウムが分子エネルギー的に最適であることがわかった。そして、これらを結合したTTX合成品は、マウス心筋細胞を用いたパッチクランプ法でナトリウムチャネルに対する結合親和性を保持することを確認した。
２）TTX輸送運搬にかかわるタンパク質に関しては、昨年度、ヒガンフグ卵巣からフグ毒結合タンパク質を単離し、その一次構造を決定し、本フグ毒結合タンパク質が卵黄タンパク質のビテロゲニン類似タンパク質であることを初めて明らかにした。ビテロゲニンは肝臓で合成され、卵巣に運搬され蓄積するので、ビテロゲニン類似タンパク質をコードするmRNAのヒガンフグにおける発現部位をRT-PCR法で調べた。その結果、ビテロゲニン類似タンパク質は雌の肝臓と卵巣で発現していることを明らかにした。さらに、ビテロゲニン類似タンパク質とTTXの結合活性を調べるため、フグと一般魚の卵からビテロゲニン類似タンパク質の精製に着手した。TTX取り込みトランスポーターに関しては、これまでにフグゲノムデータベースと次世代シーケンスアーカイブデータを利用して、TTXを輸送すると予想される有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTNをコードする推定塩基配列を抽出し、PCRにてトラフグの肝臓での発現を確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）TTXの可視化検出のための放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージング法に関しては、放射性TTX物質の候補が確定したので、その合成と性状の確認を行う。そして、放射性TTXの合成を効率的に行うため、収量の増加と反応手順の簡素化を検討し、放射性TTXの薬物物理化学特性について調べる。さらに、この放射性TTX合成物を、TTXをもたない養殖トラフグに投与して、バイオイメージングによるTTX可視化のための条件検討を行う。あわせて、放射性TTX合成に必要なTTXをフグから抽出、精製する。
２）TTX輸送運搬タンパク質に関しては、フグ毒結合タンパク質（ビテロゲニン類似タンパク質）とTTXの結合を調べるため、ビテロゲニン部分精製品を調製し、平衡透析法でビテロゲニン類似タンパク質とTTXの結合率や結合定数を測定する。トラフグ属フグの血漿に存在するTTX結合タンパク質（pufferfish saxitoxin- and tetrodotoxin-binding protein、PSTBP）はTTXだけでなく麻痺性貝毒とも結合するため、ビテロゲニン類似タンパク質についても麻痺性貝毒との結合について検討する。TTX取り込みトランスポーターに関して、今後は、トラフグOCTN遺伝子の全長cDNA配列をRACE法で決定するとともに、肝臓以外での組織発現を定量PCRで検討する。さらに、TTXの輸送能を評価するため、HEK293やMDCK IIなどの動物細胞にOCTNトランスポーターを過剰発現させるための発現ベクターを調製し、動物細胞発現系の構築を試みる。
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