2017 Fiscal Year Annual Research Report
バイオイメージング法によるテトロドトキシンと輸送タンパク質の動態解析
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15H04550
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
長島 裕二 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (40180484)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永井 慎 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 准教授 (30460497)
松本 拓也 県立広島大学, 生命環境学部, 助教 (30533400)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 水産学 / 生体分子 / テトロドトキシン / バイオイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、フグの毒化機構解明のため、１）放射性テトロドトキシン（TTX）を用いたSPECT/PETバイオイメージング法によるTTXの可視化検出法を確立し、２）TTXの体内輸送にかかわるタンパク質の特性と機能の解明を行い、３）フグ体内におけるTTXの動態を明らかにすることを目的としている。
１）放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージング法によるTTXの可視化では、これまで放射性TTXの合成について検討し、今年度は、TTXにヨウ素またはテクネシウムを付加した放射性TTXを合成した。元素付加したTTXの物理化学的性状を調べるため、非放射性ヨウ素を付加したTTXを合成して薬剤安定性、光分解、収着および吸着試験を実施し、TTX合成品はTTX標準品と同様の性状を示すことを確認した。
２）TTX輸送運搬タンパク質では、本研究で、ヒガンフグ卵巣においてフグ毒の一部は卵黄タンパク質ビテロゲニン類似タンパク質と結合していることを明らかにしたことを受け、TTXがフグ卵巣のビテロゲニンと結合するか否か調べた。卵巣からのビテロゲニン精製法を検討した後、ヒガンフグから精製したビテロゲニンはTTXと結合することを平衡透析法で確認した。
TTX取り込みトランスポーターに関しては、TTXを輸送すると予想される有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTN2をコードするslc22a5遺伝子をクローニングした。本遺伝子のcDNAは全長2,122 bpで、フグゲノムデータベースのchromosome 15に12のエクソンとして存在すると推定された。翻訳領域には554アミノ酸からなるOCTN2のタンパク質がコードされていた。RT-PCR法でトラフグ組織における発現分布を確認したところ、本遺伝子は、脳、腸、肝臓および腎臓に発現していることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージングに関しては、ヨウ素またはテクネシウムを付加した放射性TTXを合成した。合成されたTTXは凝集、分解、吸着等が懸念されるため、非放射性ヨウ素を付加したTTXを用いて、安定な溶解液を検討し、薬剤安定性、光分解、収着および吸着試験を実施した。その結果、TTX合成品はリン酸二カリウムや炭酸塩等を配合した溶解液中で安定で、TTX標準品と同様の性状を示すことを確認した。
２）TTX輸送運搬にかかわるタンパク質に関しては、これまでに、ヒガンフグ卵巣からフグ毒結合タンパク質を単離し、ビテロゲニン類似タンパク質であることを明らかにした。そこで、ビテロゲニン類似タンパク質とTTXの結合活性を調べるため、まず、市販の抗サケビテロゲニンポリクロナル抗体を用いて、魚類卵巣から効率的なビテロゲニン精製法を検討した。次に、精製したヒガンフグのビテロゲニンとTTXの結合を平衡透析法で調べ、TTXはビテロゲニンに結合することを明らかにした。
TTX取り込みトランスポーターに関しては、これまでに、次世代シーケンスアーカイブを利用して、トラフグの肝臓に発現していると推定される有機カチオントランスポーターの推定塩基配列をトラフグゲノムデータベースから候補遺伝子を選択した。それらの塩基配列情報をもとに、トラフグの肝臓から、TTXを輸送すると予想される有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTN2をコードするslc22a5遺伝子をクローニングした。全長cDNA配列の長さは2,122 bpで、翻訳領域には12ヶ所の膜貫通ドメインを有する554アミノ酸からなるOCTN2のタンパク質がコードされていた。RT-PCR法において、本遺伝子はトラフグの脳、腸、肝臓および腎臓に発現していることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）TTXの可視化検出のための放射性TTXを用いたSPECT/PETバイオイメージング法に関しては、トラフグに放射性TTX合成品を投与して、TTXの体内動態をイメージングで観察する。具体的には、肝門脈にカテーテルをつなぎ、そこから放射性TTX合成品を投与する。経時的に観察を行い、得られた動態画像からトラフグ体内におけるTTX動態を詳細に検討する。
２）TTX輸送運搬タンパク質に関しては、TTXをもたない魚種の卵巣（入手しやすいサケ（いくら）またはスケトウダラ（たらこ）を予定）からビテロゲニンを抽出、精製してTTXとの結合性を調べ、ビテロゲニンのTTX結合がフグに特異的か検討する。
TTX取り込みトランスポーターに関しては、トラフグOCTN2のTTX輸送活性を確かめるため、トラフグのOCTN2遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製し，これをイヌ腎臓由来MDCKII細胞に形質導入して，OCTN2タンパク質を過剰発現する培養細胞を作製する。そのトランスポーター発現細胞を用いてTTXの輸送試験を実施する。そして、OCTN2トランスポーターの代表的な基質であるL-カルニチンを用いてTTXの輸送が競争阻害されるか試験する。また、TTX輸送に関与すると考えられる有機カチオントランスポーターOCT6をコードするslc22a16遺伝子についてもクローニングを行い、全長cDNA配列の解明、組織発現分布ならびにMDCKII細胞を用いた発現細胞の作製を試みる。
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