2016 Fiscal Year Annual Research Report

ミエリン変性疾患解明に向けたミエリンとニューロンの新たな相互関係の解明

Research Project

Project/Area Number	15H04595
Research Institution	Osaka Prefecture University
Principal Investigator	桑村充大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (20244668)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	井澤武史大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (20580369) 山手丈至大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (50150115)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2019-03-31
Keywords	オリゴデンドロサイト / ミエリン / モデル動物 / 多発性硬化症 / 脱髄
Outline of Annual Research Achievements	dmyラットはミトコンドリアのマグネシウムチャネルであるMRS2遺伝子の変異により発症する．マイクロアレイ解析によって，dmyラットの病変進展時に伴ってTribbles homolog 3 (Trib3)が発現上昇することを見いだした．さらにリアルタイムPCR法，免疫組織化学およびウエスタンブロッティング法によって，Tribおよびその蛋白TRB3はdmyラットにおいて顕著な発現上昇を示すが，他のミエリンミュータントであるmvラットおよびVFラットでは発現変動を示さないことを明らかにし，Trib3は病変が顕著となるよりも初期に発現上昇すること，主に神経細胞とオリゴデンドロサイトにおいて発現することを明らかにした．以上の結果より，dmyラットは酸化ストレスや小胞体ストレスを受けており，それらのストレスによりTrib3の発現が上昇した可能性が示唆された．これらの成果をPLoS One誌に発表した． VFラットの原因遺伝子Dopey1の機能を明らかにする目的で，全身諸臓器におけるDopey1の発現をRT-PCR法にて検討した．Dopey1発現は中枢神経系に加えて，幾つかの実質臓器においても発現しており，その役割が注目された．現在，免疫組織化学およびin situ hibridization法を用いて発現細胞を同定し，その役割を解析している．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason dmyラットの病変進展時に伴ってTribbles homolog 3 (Trib3)が発現上昇することを見いだし，これらの成果をまとめ，PLoS One誌に発表することができた．TRMラットについては，詳細な電顕観察を着手している．VFラットの原因遺伝子と相互作用する因子を同定する目的で，免疫沈降法の予備検討も行っており，おおむね順調に進展している．
Strategy for Future Research Activity	抗DOPEY1抗体とラットの脳サンプルを用いて免疫沈降後，蛋白質溶出液を調整しLC-MS/MSによってDopey1と相互作用するタンパク質を同定する．得られた情報を元に，in vivoにおけるタンパク間の相互作用を免疫組織化学的に染色し，発現細胞と細胞内分布を検討する．さらに，前述の二重免疫電顕法にて関連分子とDOPEY1を電子顕微鏡レベルで観察し，その相互作用を明らかにする．さらにリアルタイムPCRおよびウエスタンブロットにて関連蛋白の動態を調べる． VFラット，dmyラットの病変部には細胞質が腫大したオリゴデンドロサイトが認められることを明らかにしている．この異常なオリゴデンドロサイトがどのような状況にあるのかを理解することによって，それぞれの病理発生に迫ることができると予想される．そこで，それぞれの発症ラットおよび対照ラットの脊髄白質より，トータルRNAを抽出し，RNAシークエンシングにて，発現異常を示す遺伝子をスクリーニングする．特に興味ある変動が見られた遺伝子については，リアルタイムPCR法にて発現動態を確認するとともに，特異抗体を用いた免疫組織化学あるいは特異プローブを用いたin situ hybridisation法にて可視化し，その発現動細胞を同定するとともに，発現動態を解析する．