2017 Fiscal Year Annual Research Report
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15H04612
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
LEE JAEMAN 九州大学, 農学研究院, 助教 (50404083)
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2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 糖鎖修飾 / バキュロウイルス発現系 / N型糖鎖 / O型糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バキュロウイルス発現系は、非常に優れた難分泌性機能ペプチド生産系として知られている。しかし、糖鎖構造の相違が組換えタンパク質の安定性や活性、抗原性に影響を及ぼす場合があり、創薬分野では昆虫細胞で発現したタンパク質糖鎖のヒト型化が求められている。本研究では、糖鎖関連遺伝子導入による昆虫細胞発現タンパク質糖鎖のヒト型化と細胞機能の改変により生じるタンパク質発現量低下を回避するシステムの構築を目指している。タンパク質の糖鎖修飾にはN型とO型の２種があり、N-結合型糖鎖については、その構造が哺乳類由来の構造と異なることから、そのヒト型化を目的として、多数のヒト由来糖転移酵素を導入した細胞を樹立し、その細胞を用いて生産したタンパク質の糖鎖を詳細に解析することで、付加効率に問題は残るが改変に成功した。一方、O-結合型糖鎖については、Ser/Thr残基にGalNacを付加する機能性GalNAcNを同定し、その詳細な解析を終了し、構築したO型糖鎖修飾を解析するレポータータンパク質の発現系で、Tn抗原にガラクトースが転移されているT抗原（Core1）構造の解析を進めているが、C1GalT1糖転移酵素の精製が困難であったため、人由来のC1GalT1ホモログの導入を検討した。また、タンパク質分泌量低下を回避システムに適用するため、N-末端にN-結合型、O-結合型糖鎖付加部位の導入はその効果を検証して進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
N-結合型糖鎖のヒト型化については、改変効率の低さや高い不均一性が課題となっていたため、本年度は、細胞内部での更なる改変効率向上をヒト由来糖転移酵素MGAT2およびMGAT3を導入したカイコ培養細胞安定発現株を用いて条件検討を行った。その結果、昆虫型構造から複合型構造およびbisecting構造へと改変された結果を得た。一方、in vitro での糖鎖加工のためのツールの開発に取り組み、フコース転移酵素およびフコシダーゼをカイコバキュロウイルス発現系により発現・精製した。また、カイコ培養細胞における糖鎖改変を簡便にかつ明確に観測するためのモデル組換えタンパク質として、ヒトα１酸性糖タンパク質(α1AGP)を改良したα1AGPdeltaを開発し、カイコにおける糖鎖修飾の詳細について解析した論文を発表した。
O-結合型糖鎖については、Ser/Thr残基に最初の単糖を付加するGalNAc転移酵素の詳細な解析が終了したため、その結果をまとめて論文投稿を行った。一方、Tn抗原にガラクトースを転移する糖転移酵素 C1GalT1については、カイコ内在性ホモログをクローニングし、その詳細な組織発現と局在解析を行った。さらに、機能阻害の実験を導入したところ、２種類のホモログに関しては、その機能性を検証した。しかし、BmC1GalT1の相互作用、Cosmc-likeタンパク質の探索などを解析するため、カイコバキュロウイルス発現系により精製を行ったが、膜タンパク質であるため、精製が困難であった。引き続き、可溶化条件を検討と共に、同実験を行うため、人由来のホモログをクローニングした。
タンパク質のN末端側にN-結合型、O-結合型糖鎖付加部位を導入したところ、二つ糖鎖部位を付加するより三つ糖鎖部位付加の効果があったため、難分泌性タンパク質に導入し、その解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
N-結合型糖鎖のヒト型化については、カイコ培養細胞にヒト由来糖転移酵素MGAT2およびMGAT3を導入した安定発現株を用いて、昆虫型から複合型構造およびbisecting構造へと改変された結果をまとめ論文化をする。さらに、ヒトST6Gal1を発現・精製し、十分なシアル酸転移活性をもつことを確認したため、組換えタンパク質の糖鎖を試験管内でのシアル化を試みる。
O-結合型糖鎖修飾酵素、C1GalT1とその特異的なシャペロンについては、人由来のホモログを機能阻害の実験に導入し、その機能および構造解析を進める。
昨年度までに、N-末端にN-結合型、O-結合型糖鎖付加部位を導入し、その効果を検証したため、本年度は難分泌性糖タンパク質の5種程度を選択し、生理活性を有する状態で大量生産できる事例を提示する。
最後に、これまでに確立したタンパク質分泌量低下を回避システムに適用し、分泌量が少ない糖タンパク質について、その有効性を確認し、研究を全体的にまとめる。
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