2015 Fiscal Year Annual Research Report
動物の細胞外マトリクスを標的とする病原性細菌の定着・感染機構に関する構造生命科学
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15H04629
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
橋本 渉 京都大学, 農学研究科, 教授 (30273519)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三上 文三 京都大学, 農学研究科, 教授 (40135611)
丸山 如江 摂南大学, 理工学部, 助教 (90397563)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 宿主細胞外マトリクス / グリコサミノグリカン / 連鎖球菌 / 分解酵素 / 代謝酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動物の細胞外マトリクスの主要な構成成分として存在するグリコサミノグリカン（GAG）は、ウロン酸とアミノ糖からなる二糖を基本単位とする酸性多糖であり、細胞間相互作用に重要な機能を示す。一方、ある種の細菌は、GAGを接着や分解の標的として宿主動物細胞と相互作用する。今年度は、主に、病原性連鎖球菌由来断片化GAG（二糖）を単糖に分解する不飽和グルクロニルヒドロラーゼ（UGL）を対象に、活性部位に保存されているAsp残基の機能を解析した。
連鎖球菌Streptococcus agalactiaeに由来するUGL（SagUGL）は、Asp-175を酸・塩基触媒残基として分解反応を行う。一方、活性部位に位置するAsp-115は、細菌由来UGLに保存されているにもかかわらず、その役割は不明である。そこで、SagUGLのAsp-115をAsnに置換した変異体（D115N）を構築し、組換え変異体の酵素活性を測定した。その結果、活性が顕著に低下したことから、Asp-115が酵素反応に重要であることが示唆された。その残基の機能を明らかにするため、本変異体の立体構造をX線結晶構造解析により決定した。変異体は、野生型酵素と同等の基本骨格（α6/α6-バレル）を示した。しかし、活性部位に着目して野生型酵素と比較すると、変異体のAsn-115（野生型：Asp-115）と触媒残基Asp-175の側鎖の配向が異なっていることが示された。Asn-115は、触媒残基Asp-175と水素結合により相互作用していた。そのため、この水素結合により、Asp-175が活性型の位置にシフトできなくなり、変異体酵素の活性低下が引き起こされることが明らかになった。
以上のことから、SagUGLのAsp-115は、触媒残基であるAsp-175と、互いの負電荷に基づいた静電的反発により、Asp-175を活性型配置にシフトさせることに機能すると考えられた。UGLの反応阻害剤は医薬への応用が期待されるため、本研究により得られたUGLの構造機能相関に関する知見は創薬研究への発展に繋がる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GAGの分解に関わる連鎖球菌のUGL（SagUGL）に関して、その構造機能相関が明らかになった。一方、Bacillus属細菌由来UGLの酵素反応がグリシンにより阻害されることを見出しているため、グリシン存在下でのSagUGLの酵素活性を測定した。その結果、グリシンはSagUGLの反応を阻害し、その阻害定数は3.6 mMであると決定された。以上のように、構造生物学と酵素生化学の観点から得られた知見は、効果的な阻害剤の分子設計に繋がる。
GAGが単糖にまで分解されて生じる不飽和ウロン酸の代謝に関わる連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来還元酵素（SpyDhuD）の立体構造解析も進行中である。
グラム陽性の連鎖球菌と同様、グラム陰性の病原性連鎖桿菌もヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸などのGAGを分解することが分かり、その分解過程には、UGL酵素が菌体内に発現していることを見出している。したがって、種々の病原性細菌がGAGを分解の標的とし、その分解にはUGLの働きが重要であることが示された。
以上のことから、病原性細菌におけるGAGの分解酵素と代謝酵素に関して、順調に研究成果が蓄積している。
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| Strategy for Future Research Activity |
連鎖球菌における断片化GAGの取り込み機構（フォスフォトランスフェラーゼ系PTS）を明らかにするため、輸送のアッセイ系を確立する。また、PTSの各サブユニットの発現系を構築し、結晶化に着手する。
GAG代謝に関わる還元酵素の構造解析を進め、その構造機能相関を明らかにする。特に、還元酵素の補酵素依存性に関わる構造要因を解析し、GAG代謝経路における補酵素バランスを解明する。
連鎖球菌とヒト培養細胞との相互作用を解析する。特に、GAGを介しての相互作用の有無を明らかにするため、GAG存在または非存在下での培養細胞への接着した連鎖球菌数を計測する。
各ゲノム解読細菌を対象に、GAGの分解と代謝に関わる酵素群をコードする遺伝子クラスターについて、その多様性を評価する。
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