損傷乗り越え型DNAポリメラーゼ・イータの立体構造に基づく機能解析と阻害剤の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04646
• Research Institution: Gakushuin University
• Principal Investigator: 花岡 文雄 学習院大学, 理学部, 研究員 (50012670)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: DNAポリメラーゼ / 損傷乗り越え合成 / DNA損傷 / CPD

Outline of Annual Research Achievements

ヒトPolηの構造に基づいて、鋳型DNAとの相互作用に重要と考えられるアミノ酸残基42番目および64番目のトリプトファン、378番目のロイシンをそれぞれアラニン、アラニンとセリン、アラニンとグリシンに置換した点変異体を作成し、それらのタンパク質を大腸菌にて発現・精製後、生化学的な解析を行った。W42とW64はアミノ酸置換によりDNA結合活性が低下し、特にW42AのDNA結合活性はW64AおよびW64SのDNA結合活性よりも低かった。L378はアラニンへの置換により野生型ヒトPolηとの間に顕著な差は認められなかったが、グリシンへの置換によりDNA結合活性が若干低下した。主たる紫外線損傷であるCPDを有する鋳型DNAと、それに相補的でCPDの手前までの16 merのプライマーを使用したプライマー伸長反応の結果、L378Aを除くすべての変異体で野生型と比較して17 merと19 merの生成物の蓄積がみられた。この結果から、鋳型DNAとの相互作用が弱い変異体は全て野生型よりDNA鎖の伸長反応が進みにくいことが示唆された。
やはりヒトPolηの構造情報から、297番目のトリプトファンを中心とした疎水性ポケットがヌクレオチドとの相互作用に重要であると考えられたので、W297変異体を作成してそれらの性質を調べた。その結果、野生型およびW297Kにおいて高濃度のdATPによるポリメラーゼ活性の阻害がみられたのに対し、W297YおよびW297Aではこの阻害がみられなかった。dATPのアナログについて阻害効果を調べたところ、dGTPにも若干の阻害効果がみられ、プリン環、デオキシリボース、リン酸基が重要であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究を開始するにあたって準備状況が整っていたことなどから、ほぼ順調に進んでいる。ただPolη変異体のうち欠失変異体については、組換えタンパク質が不溶性になる傾向がみられ、生化学的な解析が十分には出来ていない。一方で、変異体を発現するXP-V細胞の作成やヒトPolηの野生型や変異体と相互作用するタンパク質の探索、そしてヒトPolηを阻害する化合物の探索系の構築については次年度に向けての準備が順調に進んでおり、全体的には「(2)おおむね順調に進展している。」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

Polη変異体を発現するXP-V細胞のin vivoでの解析を進め、これまでに得られているin vitroでの生化学的な解析の結果と併せて、それぞれのアミノ酸残基の役割について総合的な判断をする。一方、組換えタンパク質が不溶性になる傾向の見られた欠失変異体については、タグを変更するなどして可溶性に出来ないかトライする。またヒトPolηの野生型および変異体と相互作用するタンパク質について、質量分析やウエスタンブロットによって同定を進め、相互作用の生理的な意義を明らかにしていく。さらに化合物ライブラリーからのヒトPolη阻害剤のスクリーニングを進めていく。

Research Products

• [Journal Article] UV-induced mutations in epidermal cells of mice defective in DNA polymerase η and/or ι. (2015)
  • Author(s): Kanao R, Yokoi M, Ohkumo T, Sakurai Y, Dotsu K, Kura S, Nakatsu Y, Tsuzuki T, Masutani C, Hanaoka F
  • Journal Title: DNA Repair (Amst) Volume: 29 Pages: 139-146
  • DOI: 10.1016/j.dnarep.2015.02.006
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Excision of translesion synthesis errors orchestrates responses to helix-distorting DNA lesions. (2015)
  • Author(s): Tsaalbi-Shtylik A, Ferras C, Pauw B, Hendriks G, Temviriyanukul P, Carlee L, Calleja F, van Hees S, Akagi J, Iwai S, Hanaoka F, Jansen JG, de Wind N
  • Journal Title: J Cell Biol Volume: 209 Pages: 33-46
  • DOI: 10.1083/jcb.201408017
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] SUMOylation of xeroderma pigmentosum group C protein regulates DNA damage recognition during nucleotide excision repair. (2015)
  • Author(s): Akita M, Tak YS, Shimura T, Matsumoto S, Okuda-Shimizu Y, Shimizu Y, Nishi R, Saitoh H, Iwai S, Mori T, Ikura T, Sakai W, Hanaoka F, Sugasawa K
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 5 Pages: 10984
  • DOI: 10.1038/srep10984
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The protein level of Rev1, a TLS polymerase in fission yeast, is strictly regulated during the cell cycle and after DNA damage. (2015)
  • Author(s): Uchiyama M, Terunuma J, Hanaoka F
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0130000
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0130000
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Different types of interaction between PCNA and PIP boxes contribute to distinct cellular functions of Y-family DNA polymerases. (2015)
  • Author(s): Masuda Y, Kanao R, Kaji K, Ohmori H, Hanaoka F, Masutani C
  • Journal Title: Nucleic Acids Res Volume: 43 Pages: 7898-7910
  • DOI: 10.1093/nar/gkv712
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural basis of pyrimidine-pyrimidone (6-4) photoproduct recognition by UV-DDB in the nucleosome. (2015)
  • Author(s): Osakabe A, Tachiwana H, Kagawa W, Horikoshi N, Matsumoto S, Hasegawa M, Matsumoto N, Toga T, Yamamoto J, Hanaoka F, Thoma NH, Sugasawa K, Iwai S, Kurumizaka H
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 5 Pages: 16330
  • DOI: 10.1038/srep16330
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] USP7 is a suppressor of PCNA ubiquitination and oxidative-stress-induced mutagenesis in human cells. (2015)
  • Author(s): Kashiwaba S, Kanao R, Masuda Y, Kusumoto-Matsuo R, Hanaoka F, Masutani C
  • Journal Title: Cell Rep Volume: 13 Pages: 2072-2080
  • DOI: 10.1016/jcelrep.2015.11.014
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 私のDNA修復研究： XPCからXPVへ (2015)
  • Author(s): 花岡文雄
  • Organizer: 新学術領域研究「ゲノム普遍的制御」（H22～H26年度）公開シンポジウム『ゲノム安定性の機構と生命の維持ー進化、癌化、老化の理解のために』
  • Place of Presentation: 京都大学
  • Year and Date: 2015-08-28 – 2015-08-29
  • Invited
• [Presentation] Regulation of the protein level of Rev1 in fission yeast. (2015)
  • Author(s): Uchiyama M, TerunumaJ, Hanaoka F
  • Organizer: Zing Genomic Integrity Conference 2015
  • Place of Presentation: Cairns, Australia
  • Year and Date: 2015-08-01 – 2015-08-05
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Forty years of DNA damage tolerance. (2015)
  • Author(s): Hanaoka F
  • Organizer: 15th International Congress of Radiation Research (ICRR 2015)
  • Place of Presentation: 京都国際会館
  • Year and Date: 2015-05-25 – 2015-05-29
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] Function of translesion DNA polymerases in genome stability (2015)
  • Author(s): Masutani C, Kanao R, Hanaoka F
  • Total Pages: 260
  • Publisher: Research Signpost