2016 Fiscal Year Annual Research Report
Hierarchical self-organization of circadian system: synchronization of cellular oscillators and pacemaker coupling
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15H04679
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
本間 さと 北海道大学, 脳科学研究教育センター, 招へい教員 (20142713)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
榎木 亮介 北海道大学, 電子科学研究所, 准教授 (00528341)
小野 大輔 名古屋大学, 環境医学研究所, 助教 (30634224)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 生体リズム / 時計遺伝子 / 視交叉上核 / イメージング / 結合振動子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類生物時計視交叉上核（SCN）における階層性多振動体構造の自己組織化に関わる分子、細胞、ネットワークメカニズムについて、本年度は、以下の２つの研究を行った。
1.中枢時計自己組織化におけるGABAの役割：
GABAノックアウトマウスは出生後直ちに死亡するため、胎生末期のマウスのSCNを培養することで、SCNにおけるGABAの機能を検討した。2種のGABAノックアウト（vesicular transporter欠損とGAD65/67ダブル欠損）マウスを作成し、電気活動と遺伝子発現リズムを計測したところ、GABA欠損により24時間を通して電気活動に数分間隔でバーストが生じるが、時計遺伝子発現リズムは野生型と何ら変化がないことが分かった。GABAはサーカディアンンリズム発振に関与しないが、出力ノイズを減らし、リズム出力を安定化させる機能をもつことを明らかにした。
2.細胞間リズム同期の生後発達：
自己組織化による組織時計形成には細胞間リズム同期が必須であるが、細胞時計の同調因子は生後発達の過程で変化する。離乳期にこの組織化に障害が生じるCRY欠損マウスを用い、生後発達の各段階における同調因子を探索した。その結果、CRYマウスでは、生涯を通じSCNにおけるAVPの産生が著しく減弱していること、CRY1/2/VIP受容体のトリプルノックアウトマウスのSCNでは新生児期にも細胞リズム同期みられないことが分かった。新生児期における同期にはVIPとAVPの双方が関与していること、CRY1/2ダブルノックアウトマウスの新生児期におけるリズム同期はVIPによって行われることが明らかとなった。一方、成獣SCNではAVPにより細胞間リズム同期が生じることを、共培養での薬理実験、AVP分泌を欠損するAVP-Elucレポーターマウスとの共培養などの検討で明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
哺乳類中枢時計である視交叉上核（SCN）が、ダイナミックで広範な適応と安定したリズム発振を同時に可能とする階層性多振動体構造の自己組織化に関わるメカニズムを２つの研究で検討し、両実験を通じ、約24時間という長い周期のリズム同期には、SCNにおける神経ペプチドが重要な役割を果たすこと、GABAは速い情報伝達に関与するが24時間リズムには関与しないこと、GABAは24時間どの位相においてもバースト発火を抑え、24時間時計としての精度を上げていることを明らかにした。SCNのGABAについては、これまで、常に抑制性に作用する、1日の位相によって、あるいは部位によって、抑制性、興奮性の作用機序が変わる、などの対立する報告が多数あった。今回ノックアウトマウスを用いることで、他の脳部位とは異なりバーストフリーの時計組織の形成に関与することを明らかにした。また、リズム同期については、発達の過程でAVPによる振動細胞クラスター、VIPによる振動細胞クラスターが生じこれらがカップリングしていくという新たなモデルも提唱することができた。これらの成果を英文原著論文5編で発表することができ、また国際会議の教育講演をはじめとする招聘講演で発表することができた。しかし、GABAの研究成果は、査読者より、胎生期のみのデータであること、培養下でのみの計測であることの問題指摘があり、追加実験を行っている。このため、総合的に判断し、おおむね順調に進捗していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
SCNにおけるGABAの機能については、成獣のSCN特異的にノックアウトを生じさせることで、その生理機能を検証する必要性がある。そこで、アデノ随伴ウィルスベクターを用い、SCN内に注入し、部位特異的時期特異的のGABAノックアウトを生じさせる予定である。これらのマウスの自発行動における表現型を詳細に検討すると同時に、SCN内でのバースト発火を、マルチユニット活動のin vivo計測あるいは、カルシウムのin vivoイメージングで明らかにしていきたい。
また、神経発火やカルシウム変動を長期経時的に計測することで、細胞リズムがどのようにネットワークレベルのリズムに統合され出力されるかのメカニズムを検討する。
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