膵内・外分泌細胞の再生機構：インクレチン受容体陽性細胞の膵再生における役割の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04812
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 洪 繁 慶應義塾大学, 医学部, 准教授 (90402578)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石黒 啓一郎 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (30508114) ; 竹田 直樹 熊本大学, 学内共同利用施設等, 助教 (90304998)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: Glp-1受容体 / ノックインマウス / 膵前駆細胞

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度の計画：Glp1 受容体(Glp1-r)ノックイン(KI)マウスを作成と、細胞系譜追跡実験
平成27年度は、Glp-1受容体のノックインマウスを作成し、Glp-1受容体を発現する細胞の蛍光標識と、Cre-ERT2システムとRosa26-Brainbowマウス、Rosa26-LacZマウスを用いることで、Glp-1受容体発現細胞の細胞系譜追跡実験を予定した。
そこで、(1)Glp-1受容体遺伝子のノックインマウスを作成するためのノックインベクターの作成、(2)作成したノックインベクターを用いたマウスES細胞の組換え体の取得、(3)組換えマウスES細胞のマウス胚盤胞へのインジェクションと組換えマウスの作出、(4)キメラマウスを交配し、マウスGlp-1受容体ノックインマウスの作出を行った。
作成したノックインマウスを用いて、組織での蛍光タンパクVenusの発現及び、Cre-ERT2遺伝子の発現をチェックしたところ、残念ながら組織でのVenusタンパクの発現は認められず、cre-ERT2遺伝子の発現は非常に弱くしか確認できなかった。我々のノックインマウス作成用ベクターは蛍光タンパクとcre-ERT2遺伝子をタンデムに繋いだコンストラクトであったため、2つのタンパクの発現量が非常に少なくなったと考えられた。
そこで、平成27年度途中より、再度Venus及びcre-ERT2遺伝子を別々にGlp-1受容体遺伝子にノックインするためのコンストラクトを作成し、現在マウスES細胞に遺伝子導入することで、組換えES細胞を取得する準備を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マウスGlp-1受容体ノックインマウスについては、当初予定通り作出が進行し、平成27年度途中にノックインマウスを得ることができた。しかしながら、当初Glp-1受容体の蛍光標識とcre-ERT2を用いた細胞系譜追跡実験の2つを同時に行えるようにベクターを設計していたが、このベクター設計では、Glp-1受容体遺伝子では両遺伝子の発現が予想より少なく、解析が困難であることがわかった。そこで、平成27年度途中より、再度ベクターを再設計し、ベクターのコンストラクションから開始した。現在、ふたつ目のベクターの作成は終了し、マウスES細胞への遺伝子導入も終了しており、順調に組換え体をえる準備が進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

現在、作成中のマウスES細胞組換え体は、スクリーニングで組換え体が得られ次第、マウス胚盤胞にインジェクションし、遺伝子組換え体を得る予定である。
また、ノックインマウスが得られ次第、解析を行う。