2015 Fiscal Year Annual Research Report
慢性腎臓病・加齢腎の基盤病態としての血管内皮障害の分子機序解明と治療戦略の構築
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15H04838
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
柏原 直樹 川崎医科大学, 医学部, 教授 (10233701)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 稔 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (70449891)
春名 克祐 川崎医科大学, 医学部, 講師 (40341094)
桑原 篤憲 川崎医科大学, 医学部, 講師 (50368627)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 内皮機能障害 / 酸化ストレス / ポドサイト / 一酸化窒素 / アルブミン尿 / in vivo imaging / 多光子レーザー顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）podocyte障害機序としてのECDの関与を解明する(内皮→podocyteクロストーク)
ESRDへ至る最終経路にpodocyte injury/lossが重要であることは間違いない。一方で、CKDの主要原因疾患である糖尿病・高血圧・メタボリックシンドローム等ではECDが最早期病態として先行出現する。「糖尿病等の生活習慣病を基盤としたCKDではECDかpodocyte injury/lossへと至り、アルブミン尿、腎機能障害を来す」と仮説した。本仮説検証のために、内皮特異的NADPH oxidase（tie2-NOX2 Tg）マウスと糖尿病発症Akitaマウスを交配し、糖尿病モデルを作成した。アルブミン尿が検出される以前の超早期の糸球体透過性変化を２光子レーザー顕微鏡と蛍光色素を用いて検出した。糸球体内皮細胞変化を形態的（Glycocalyx変化をレクチン染色で検出）、機能的（in vivo imagingによるNO検出）で評価した。上皮細胞変化を走査電子顕微鏡、ネフリン、ポドシン発現変化等で評価する。その結果、tie-2 NOX2 TG-Akita糖尿病マウス4週齢の時点で、糸球体透過性の亢進、糸球体内皮障害を認め、興味深いことに上皮細胞障害を認めた。
２）脳内微小血行動態、透過性変化、ECDの解析システムの構築
マウス頭蓋骨を除去（硬膜保持）し、cranial windowを作成し２光子レ－ザ－顕微鏡と蛍光標識デキストランを用いることで脳皮質部微小血流を可視化できた。蛍光標識小分子プローブを用いて脳内血管透過性変化、blood brain barrier(BBB)機能変化を解析する方法をほぼ確立することができた。CKDモデルにおける脳内微小血行動態変化、透過性変化、BBB機能変化の解析に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の主要目的のひとつである「podocyte障害機序としてのECDの関与の解明(内皮→podocyteクロストーク)」を証明することできた。podocyteはVEGF等の増殖因子発現を介して糸球体内皮細胞の分化に必須である(podocyte→内皮クロストーク)。一方で、糖尿病・高血圧等ではECDが最早期病態として先行出現する。糸球体内皮からpodocyteへのクロストークが存在し、ECDからpodocyte injury/lossへと至る病態も存在すると想定していた。本研究で内皮特異的NADPH oxidase（NOX2）Tg/糖尿病モデルを作成すると、内皮細胞障害に続発してpodocyte障害が出現することを証明することができた。
CKD（糖尿病、5/6腎摘）モデルを用い２光子レ－ザ－顕微鏡を用いて、脳内微小血行動態変化、透過性変化、BBB機能変化と認知機能変化（水迷路試験、Y字迷路試験）を解析する予定であった。しかしながら、これらモデルマウスでは高次脳機能変化を容易に来さず、別モデルの選択が必要であると考えるに至った。
CKDモデルマウスに脳梗塞/局所脳虚血モデルを作成する予定である。光刺激増感剤ローズベンガルを静脈内投与し、緑色レーザーを動脈局所に照射することで血小板血栓を作成する。梗塞部及び周辺ベナンブラ部の血行動態変化、透過性変化を解析する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）防御機転としての転写因子Nrf2/Keap1の役割の解明 ：NF-E2-related factor 2（Nrf2）は抗酸化酵素・解毒酵素群の発現を包括的に制御し生体防御に重要な役割を果たす転写因子である。定常状態では2分子のKeap1に補足され、ユビキチン-プロテアソーム経路で分解制御されている。ROS/親電子物質に暴露されるとKeap1分子内のシステイン残基が修飾され、Nrf2は核内へ移行し、多くの抗酸化酵素・蛋白を誘導する。CKDの基盤病態であるROS/NO不均衡に対するNrf2/Keap1経路活性化の防護機転としての意義をNrf2ノックアウトマウス（KO）（東北大学 山本雅之教授より供与）を用いて検証する。Nrf2-/-にAkita糖尿病モデルを交配し糖尿病モデルを作成し、ROS/NOの不均衡、病態変化を評価する。sulforaphane等のNrf-2活性化剤の作用を検討する。Keap1はNF-kB発現をIkB kinase(IKKβ)抑制を介して制御している。これらモデルにおけるNF-kB活性化動態も解析する。
２）酸化ストレスと微小炎症（microinflammation）の連結機序としてのインフラマソーム活性化の役割の解明：インフラマソーム(Inflammasome)は，自然炎症、生活習慣病関連の慢性炎症の病態形成に深く関与する。糖尿病モデル腎組織においてミトコンドリア呼吸鎖由来のROS産生が亢進し、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の酸化修飾が生じることを明らかにした。mtDNAはインフラマソームを活性化することが示されている。CKD病態形成におけるインフラマソームの関与を解析する。NLRP3,ASC-KOマウス（自治医科大学 高橋将文教授より供与）に糖尿病（STZ）,UUOモデルを作成し病態形成におけるインフラマソームの関与を解析する。
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Research Products
(17 results)
