2015 Fiscal Year Annual Research Report
恒常的カルシウム流入により引き起こされる筋ジストロフィーの病態解明
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15H04846
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| Research Institution | National Center of Neurology and Psychiatry |
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Principal Investigator |
野口 悟 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所疾病研究第一部, 室長 (00370982)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原 雄二 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (60362456)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | カルシウム / チャンネル / 遺伝病 / 骨格筋 / 糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細管集合体（Tubular Aggregates: TA）を伴う筋ジストロフィーの発症機序及び分子病態を解明することを目的とする。TA を伴う筋ジストロフィーの原因遺伝子変異が同定され、細胞膜のストア作動性カルシウムチャネル (SOC)の活性化による恒常的な細胞内へのカルシウム流入が起こっていることが、患者筋細胞で確かめられた。本研究では、この恒常的な細胞内へのカルシウム流入がいかに筋ジストロフィーを発症しうるのか、また、いかにTA は形成されるのかを、患者筋細胞、遺伝子改変より作製したモデル細胞及びモデル動物を用いて、分子レベルで迫ろうとするものである。本年度の研究では、1)新規TAM患者の筋細胞でのSOC開口の解析、2)TAM患者骨格筋細胞筋小胞体カルシウム濃度の測定、3)GFPT１遺伝子変異患者細胞における糖鎖修飾の解析とSOC開口の解析、4)優性変異ORAI1モデルマウスの作成を行った。1)では、新たに、ORAI1変異１名、STIM１変異3名のSOC開口の測定を行った。いずれの患者細胞または変異タンパク質の導入においても、細胞外から細胞内への恒常的なカルシウム流入が観察され、SOCの恒常的開口がTAMをひきおこすというコンセプトを支持していた。2)では株化細胞を用いて、解析系を整備した。3)では、 GFPT１遺伝子変異患者細胞において、SOC開口と細胞内UDP-GlcNAcの減少を認めた。しかしながら、骨格筋組織におけるSTIM１の糖鎖修飾の変化は検出できなかった。４)優性変異を持つORAI1を発現するTgマウスを作製したが、生後すぐに致死であった。Tg胎仔マウス下肢骨格筋では筋線維の崩壊などは認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1)新規TAM患者の筋細胞でのSOC開口の解析、2)TAM患者骨格筋細胞筋小胞体カルシウム濃度の測定、3)GFPT１遺伝子変異患者細胞における糖鎖修飾の解析とSOC開口の解析までは、ほぼ順調に進んでいる。4)優性変異ORAI1モデルマウスの作成では、骨格筋特異的プロモーターによる変異ORAI1トランスジェニックマウスは、生後致死のため、系統維持及び表現型の解析が出来なかった。骨格筋での変異Orai1の過剰発現が骨格筋機能不全を導いたものと考えられるが、その分子病態の詳細の解析には至らなかった。ノックインマウスを用いて、内在性遺伝子の発現調節のもとに変異Orai1を発現するマウスを作製する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.新規TAM患者の筋細胞でのSOC開口の解析―STIM１, ORAI1遺伝子に変異を見出した患者由来細胞における、SOCを介した細胞外から細胞内へのカルシウム流入を蛍光カルシウムプローブにて測定する。また、STIM1変異遺伝子／YFPレポーターを作成して、培養細胞におけるSTIM1の活性化をモニターする。また、変異STIM１における変異部位の構造変化を、FRETを用いて測定するとともに、SOC補助因子との結合性に関して解析する。
2.TAM患者骨格筋細胞筋小胞体カルシウム濃度の測定―筋小胞体内のカルシウム濃度をER局在性シグナルのついたcameleon分子を発現させ、解析する。今年度はエレクトロポレーションにより患者細胞への遺伝子の導入を行う。細胞外液のカルシウム濃度に対する、上記変異細胞の細胞内及び筋小胞体内カルシウム濃度を測定する。
3.GFPT１遺伝子変異患者細胞における糖鎖修飾の解析とSOC開口の解析―GFPT１変異患者由来線維芽細胞のUDP-GlcNAc生合成経路中間体の解析を行う。GFPT１活性測定と検出のしやすい生合成経路における中間生成物の同定を進める。また、上記STIM/YFPタンパク質を用いて、GFPT１変異患者由来細胞におけるSTIM分子の活性化と糖鎖修飾を解析する。
4.優性変異ORAI1モデルマウスの作成―今年度はCrispr/CAS9を用いたノックインマウスの作成を試みる。作製されたマウスについて、運動能力を解析するとともに、週齢を追って骨格筋の生理収縮機能と筋病理の解析を行う。また、得られたマウスから初代培養細胞を調製して、上記のカルシウムイメージングを行う。
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