2015 Fiscal Year Annual Research Report

アカゲザル脂質免疫研究を基盤にした、新たな抗結核ワクチンの開発

Research Project

Project/Area Number	15H04869
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	杉田昌彦京都大学, ウイルス研究所, 教授 (80333532)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中村孝司北海道大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20604458)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	感染症 / 細菌 / 結核 / 脂質 / ワクチン
Outline of Annual Research Achievements	まず、懸案であったモルモットインターフェロンガンマ測定系について進展があった。モルモットインターフェロンガンマを認識するマウスモノクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体の開発・検証を行い、両者の組み合わせによるサンドイッチELISAおよびELISPOT法の確立に成功した。このELISPOT法を活用し、結核菌感作動物個体におけるタンパク質特異的メモリーT細胞と脂質特異的T細胞のメモリーT細胞の検証を行い、両者が異なる臓器および異なるタイムポイントで活性化する可能性を見出しつつある。このことは、今後の抗結核脂質ワクチンの開発において、重要な視点となることが考えられた。アジュバントの開拓においては、候補であるグリセロールモノミコール酸（ヒトMincle特異的リガンド）の生物活性を個体レベルで検証する取り組みを進めた。その結果、グリセロールモノミコール酸が肉芽腫形成能を有することを初めて見いだした。その肉芽腫を構成する細胞の質的評価を目論み、モルモットMincle、モルモットアルギナーゼ１、モルモットiNOSを認識するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体の開発に成功した。最後に、新しい結核制御法の確立には、結核肉芽腫形成の分子・細胞機序を理解することが不可欠と考え、肉芽腫形成を担う鍵分子の探索を行った。その結果、肉芽腫深部には好中球由来因子が蓄積することを見いだし、その因子を同定した。またその因子の機能を阻害することにより、肉芽腫形成自体が顕著に抑制されることを見いだした。この発見をもとに、この因子の阻害と抗結核ワクチンを併用した新たな結核制御の戦略を構築するに至った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason モルモットおよびアカゲザルを用い、グルコースモノミコール酸を用いた抗結核ワクチン開発の推進に向けた研究を展開した。まず、懸案であったモルモットインターフェロンガンマ測定系を完成させた。マウスモノクローナル精製抗体とウサギポリクローナル精製抗体の組み合わせによるサンドイッチELISAおよびELISPOT法を確立し、BCG感作モルモット脾臓においてculture filtrate protein特異的T細胞の存在を実証した。一方、この個体はグルコースモノミコール酸を用いた皮内テスト陽性であるが、脾臓におけるグルコースモノミコール酸特異的T細胞の明確な検出には至らず、脂質免疫が異なる臓器、異なるタイムポイントで惹起されている可能性が示唆された。一方、脂質ワクチンに供するアジュバントの開拓について、Macrophage inducebile C-type lectin (Mincle)リガンドに着目した研究を展開した。とりわけ、2014年に研究代表者が発見したヒトMincleの新リガンド（グリセロールモノミコール酸）について、その生物活性の検証を行い、肉芽腫形成能を有することを明らかにした。さらに肉芽腫構成細胞の質を評価すべく、モルモットMincleやモルモットアルギナーゼ１に対するモノクローナル抗体、モルモットiNOSに対するポリクローナル抗体の作出に成功した。最後に、肉芽腫形成において重要な好中球由来因子を同定し、その機能抑制が及ぼす個体レベルでのインパクトを明らかにした。この経路と脂質ワクチンを組み合わせる新たな戦略が構築された。
Strategy for Future Research Activity	これまでの研究成果から、グルコースモノミコール酸を主体とした抗結核ワクチン開発において必要となるモルモットならびにアカゲザル免疫解析系の確立は、CD1テトラマーを除いて、ほぼ完了した。今後の研究の推進において、以下の２点が重要であると考えている。（１）アジュバントの開拓：Mincleリガンドのうち、トレハロースジミコール酸は強い刺激活性を有するがゆえに過度の組織破壊を伴い、アジュバントとしての使用が困難である、一方、グリセロールモノミコール酸は毒性が低いことからアジュバントとしての現実的である。そこで、ヒトMincleトランスジェニックマウスやモルモット、アカゲザルを用い、グリセロールモノミコール酸の生物活性を個体レベルで検証する作業を進める。また研究分担者は、STINGリガンドを用いた新たなアジュバント搭載リポソームの開拓に成功しており、その評価を進めていく。（２）結核制御には肉芽腫の形成機序の理解が不可欠である。平成27年度において、肉芽腫形成の鍵となる好中球由来因子の同定に成功した。この因子の機能を阻害することにより組織化された肉芽腫形成が抑制されることから、菌と獲得免疫系との接点が拡大することが考えられ、この因子の阻害剤を併用したBCGワクチンなどの新たな着想が生じてきた。この発想に基づき、主としてモルモットを用いながら、検証作業を進めていく。最後に当初設定した課題のなかで残されているCD1テトラマーの作製について、努力を積み重ねていく。成功への鍵となるステップは、グルコースモノミコール酸のリコンビナントCD1分子へのローディングである。高度の疎水性を有する結核菌由来脂質ではなく、コリネバクテリウム由来の短鎖グルコースモノミコール酸で代用することが現実的と考えられ、その推進を図る。