2015 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトiPS細胞由来スキャフォールドフリー三次元人工組織による軟骨再生技術の開発
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15H04958
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中村 憲正 大阪大学, 国際医工情報センター, 招へい教授 (50273719)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
名井 陽 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (10263261)
藤江 裕道 首都大学東京, システムデザイン学部, 教授 (20199300)
寺村 岳士 近畿大学, 医学部附属病院, 講師 (40460901)
福田 寛二 近畿大学, 医学部, 教授 (50201744)
吉川 秀樹 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 理事・副学長 (60191558)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 間葉系幹細胞 / フィーダーフリー培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まずepisomal iPS細胞（409B2株）を理化学研究所から供与を受け、コーティング剤・Laminin-511 E8フラグメント (iMatrix, ニッピ)と多能性幹細胞用人工培地・mTeSR (ベリタス)を用いて安定的にfeeder lessでchemical definedにiPS細胞を維持することが可能であった。その多能性はOct3/4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81の免疫染色、SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, rBC2LCNのFACS解析、Oct3/4, Nanog, Sox2, Lin28aのqRT-PCR解析から判断した。
次にこのfeeder less培養したepisomal iPS細胞を用いて胚様体を介した間葉系幹細胞（MSC）様細胞の誘導方法の検討を行った。第1ステップとして胚様体形成条件を検討した。胚様体形成に使用される培地にも様々報告があり、基礎培地（DMEM, aMEM, DMEM/F-12）や血清（FBS, KSR）、成長因子（bFGF, EGF, PDGF）などの選択肢が挙げられる。結果として5%FBS, 5% KSR含有DMEM/F-12に10ng/mL bFGFを添加した培地で安定的に胚様体が形成可能で、その後の接着培養によるMSC様細胞の誘導効率も格段に高かった。一方、bFGF不含の物や、FBSのみの使用では胚様体形成能が悪く、誘導MSCも増殖性を有さない老化した細胞が得られた。栄養因子・成長因子過多な人工培地からの急激な環境変化によるストレスだと考察される。
上記手法で誘導したMSC（iMSC）は早期に間葉系幹細胞マーカーの発現の有した一定のポピュレーションに収束し、2か月以上維持培養が可能であった。また長期培養により細胞老化を起こし、腫瘍細胞のような異常な増殖能を示すことは無かった。（N = 3）
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請計画では平成27年度に理研から入手したepisomal iPS細胞（409B2）株の維持培養および胚様体を介した間葉系幹細胞誘導法の至適条件の検討である。我々は安定的なフィーダーフリーのiPS細胞の培養およびそれから胚様体を介した間葉系幹細胞誘導プロトコルを完成させ、再現性高いものを得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在再現性高い誘導プロトコルを完成させており、今後はそのiMSCの品質を精査している必要がある。まずはiMSCの安全性についてin vitroの評価を行う。試験としては、多能性幹細胞特異的糖鎖（TRA-1-60など）のFACS解析および特異的転写因子（Oct3/4, Nanog, Sox2, Lin28a）のqRT-PCR解析を行い安全性の検査とする。
様々な疾患に対して間葉系幹細胞を用いた治療が存在するが、我々の樹立したiMSCがどのような分化能を有しているかを調べることでどのような疾患に適応可能か示唆することができる。まずはin vitroにおける骨分化、軟骨分化誘導試験を行う。骨分化誘導試験としては、βグリセロフォスフェート、デキサメタゾン、アスコルビン酸を用いた分化培地での培養後、ALP発現、石灰化基質沈着を評価する。軟骨分化誘導試験としては、細胞塊作製後、TGFβ、BMPを含んだ培地で培養し、軟骨特異的糖基質の産生量で評価する。これらの分化誘導法は生体由来MSCにおける分化誘導試験と同様の手法である。
次にiMSCを高密度培養することによりiTECの作製を行う。我々は既に生体由来MSCからのTEC作製の際に細胞培養密度・期間によって組織の体積、水分含有量、力学特性（破断強度、硬度）が変化することを確認している。iPS細胞由来MSCにおいても同様の検討により容易に移植所作が可能なiTECの開発を目指す。
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[Presentation] Hypoxic Pretreatment Promotes Chondrogenic Capacity of Scaffold-free Tissue Engineered Construct Derived from Synovial Mesenchymal Stem Cells2015
Author(s)
Yasui Y, Chijimatsu R, Moriguchi Y, Koizumi K, Sugita N, Sakaue M, Myoui A, Yoshikawa H, Nakamura N
Organizer
10th Biennial Congress of International Society of Arthroscopy, Knee and Orthopaedic Sports Medicine
Place of Presentation
Lyon, France
Year and Date
2015-06-07 – 2015-06-11
Int'l Joint Research
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[Presentation] Optimization of Mesenchymal Stem Cell Isolation From Synovial Membrene2015
Author(s)
Sugita N, Moriguchi Y, Sakaue M, Yasui Y, Koizumi K, Chijimatsu R, Shimomura S, Ikeda Y, Yoshikawa H, Nakamura N
Organizer
8th World Congress of International Cartilage Repair Society
Place of Presentation
Chicago,USA
Year and Date
2015-05-28 – 2015-06-03
Int'l Joint Research
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