2016 Fiscal Year Annual Research Report
急性生体侵襲下における単球系細胞の機能解析と組織傷害関連物質（DAMPs）の制御
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15H05009
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
並木 淳 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (20189195)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 臨床 / 生態学 / 生体侵襲 / 単球 / 肝損傷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重症外傷や敗血症などの急性生体侵襲後には血中にDAMPs(Damage Associated Molecular Patterns)が遊離し、各種免疫反応を惹起していると考えられている。これまで重症鈍的腹部外傷の有用な動物モデルは存在しなかったが、循環血液中へのDAMPsの遊離を明らかにするため鈍的肝損傷の新たなモデルマウスを作成した。8週令の野生型C57BL/6マウスを全麻下にて開腹し、dermapunchを用いて肝臓の右内側葉・左内側葉に各1穴と左外側葉に2穴の損傷を作成した。肝損傷作成後、2・24・96・168時間の生存期間を経て動物を全麻下に開腹し下大静脈から採血した。血液から血漿を分離して、血漿中のasparate aminotransferase (AST)、 alanine aminotransferase(ALT)、interleukin-6 (IL-6)、HMGB-1、total histone H3、 total histone H4、mitochondrial DNAを、ELISAもしくは定量rt-PCRで測定した。
肝損傷モデルマウスにおいて、ASTとALTは損傷2時間後および24時間後においてsham損傷群に比し有意に肝損傷群で高値を示した。HMGB-1のレベルは、損傷2時間後においてsham損傷群に比し有意に肝損傷群で高値を示した。一方、損傷24時間後以降ではHMGB-1のレベルに2群間で有意な差はみられなかった。Mitochondrial DNAのレベルには、sham損傷群と肝損傷群に有意な差はなかった。Total Histone H3/H4のレベルは、損傷2・24・96・168時間の全ての生存期間においてsham損傷群に比し有意に肝損傷群で高値を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
重症腹部鈍的外傷における肝損傷モデルマウスを用いた動物実験の結果を、国際学会において報告した。一方、臨床例における症例の収集は遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
重症腹部鈍的外傷における肝損傷モデルマウスを用いた動物実験を継続する。
臨床例における検討は、sepsis軽症患者ならびに正常対照群から臨床検体を採取し、以下の解析を進める。末梢血から密度勾配法により末梢血単核球（PBMC）を分離し、フローサイトメトリーによる細胞プロファイルの1次解析を行う。1次解析と同時にセルソーターによって細胞表面抗原CD14陽性の単球を採取し、ELISAによるリン酸化Histone H3蛋白質の発現解析を行う。同時に採取した末梢血から血漿を分離し、DAMPs（total Histone H3・Histone H4、HMGB1、mitochondrial DNA）をELISAもしくは定量rt-PCRで測定する。得られた結果をこれまでに得られたsepsis症例の測定値と比較検討する。
また、血管内皮細胞傷害の修復・再生に関わる血管内皮細胞に与えるDAMPsの影響について、以下のin vitroの実験を行う。マウス骨髄細胞由来の培養血管内皮細胞（EC）および血管内皮前駆細胞（EPC）を用いて、培養液中に添加したHistone H3およびHiston H4がECおよびEPCの機能障害と細胞死に与える影響を、免疫細胞学的に検討する。培養液中に放出されたDAMPs（total Histone H3・Histone H4、HMGB1、mitochondrial DNA）をELISAもしくは定量rt-PCRで経時的に測定し、細胞傷害についてはCalcein/EthD-III（生細胞/死細胞検出キット）を用いて評価する。
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