2015 Fiscal Year Annual Research Report
がん化リスクのない多能性幹細胞の医療応用～新規培養法によるバイオエナメルの創製～
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15H05046
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
中原 貴 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (10366768)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井出 吉昭 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (70409225)
石川 博 日本歯科大学, 生命歯学部, その他 (30089784)
橋本 尚詞 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (80189498)
立花 利公 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (80163476)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 歯学 / 細胞・組織 / 再生医学 / 移植・再生医療 / 発生・文化 / 多能性幹細胞 / エナメル芽細胞 / エナメル形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、懸滴培養から灌流培養に移行する新規器官培養システムにより多能性幹細胞から胚子様モンスターを作製し、同組織に存在する歯胚原基からエナメル質形成細胞の分離を目指している。三胚葉に由来する組織から構成される胚子様モンスターを体外で作出できる本技術は、同モンスターがES細胞に由来する組織でありながら腫瘍化・がん化がみられない手法であり、多能性幹細胞からの機能性細胞の獲得法として新たなアプローチを提供している。本年度は、懸滴培養による胚様体形成から灌流培養に移行する一連の培養システムについて再検証を行い、さらに安定的に胚子様モンスターの形成ができるような培養プロトコールの改良を図っている。
また、多能性幹細胞の医療応用を目的とした上記の研究と並行して、エナメル質の形成を担うエナメル芽細胞の特異的なキャラクターの解析のため、in vitroにおける安定的な細胞材料を得ることを目的とした細胞株の樹立を進めている。本年度は、クラウン系ミニブタ胎仔の歯胚の初代培養を通じて、エナメル上皮組織に由来する上皮細胞の分離と同定について報告した（Nakahara T et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2015）。この実験は、歯胚組織から遊走してコンフルエントに達した初代培養から、目的の細胞集団を選択的に分離できる細胞操作技術 “セル・フィッシング法” によって、敷石状を呈する細胞集団を分離した。その後、様々な解析に基づいてエナメル芽細胞の特徴を有する上皮細胞であることを明らかにした。
以上のように、多能性幹細胞からのエナメル質形成細胞の誘導と細胞株の樹立、さらにヒトに準ずるミニブタのエナメル芽細胞株の活用によって、再生エナメル質「バイオエナメル」の創製を目指し、歯の再生を切望する患者や社会に貢献できる “安全な” 再生医療技術の開発に努める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
多能性幹細胞を用いたエナメル質形成細胞の分化誘導と細胞株樹立にあたり、懸滴培養による胚様体の形成から灌流培養に移行して胚子様モンスターを形成する高度な培養技術が必要となる。将来的なヒト多能性幹細胞の応用と臨床応用を視野に入れた場合、患者のiPS細胞などを用いた胚子様モンスターの高い形成効率が望める培養法の確立が求められる。そのため、細胞の個体差や培養条件に左右されることなく胚様体と胚子様モンスターが形成できるように一連の培養法の改良を進めている。
さらに、多能性幹細胞からエナメル質形成細胞の誘導が奏功した場合、次に求められるのは同細胞のキャラクターを把握した細胞操作とエナメル質の形成法の開発である。しかし従来の研究では、生涯エナメル質が形成されつづけることで知られるマウスやラットの切歯に由来する細胞株が広く使用されてきた。常生歯と呼ばれるげっ歯類に特有な歯は、常生歯をもたないヒトの歯とは決定的な差異が存在することが考えられる。現状、ヒト由来のエナメル芽細胞を用いた研究は困難であるため、ヒトに準ずる高等哺乳類であるミニブタ由来のエナメル芽細胞の分離・同定を報告した本年度の研究成果の意義は大きい。
また、同細胞の選択的な分離培養を可能とした “セル・フィッシング法” は、我々の研究グループが有するユニークな細胞分離技術である。本技術は、多能性幹細胞由来の胚子様モンスターから目的の細胞集団を選択的に分離することにも活用できるため、懸滴培養から灌流培養に移行する新規器官培養システムとあわせて、本研究独自のアプローチを提供する。以上の進捗状況を踏まえて、本研究課題の自己点検による評価は、「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの器官培養実験の結果と培養プロトコールを再検証したところ、最終的に作出される胚子様モンスターのさらなる形成効率の向上を図るため、器官培養初期の懸滴培養による胚様体形成を含めた培養プロトコールの検証と改良を積極的に推進する。
また、昨年度は、ミニブタ胎仔の歯胚由来のエナメル芽細胞の分離に成功し、その詳細なキャラクターについて報告した。同細胞は、アメロブラスチンやアメロゲニンなどのエナメルマトリックスタンパクを豊富に産生・分泌する上皮細胞であり、現在もこれらの表現型を維持したまま安定に継代培養が可能となっている。今後は、長期間の継代培養を経た同細胞のキャラクターの詳細な解析を進め、エナメル芽細胞の特徴を有するstable cell lineの樹立を試みる。この細胞株の樹立に成功すれば、従来の研究で広く知られるマウス切歯（常生歯）に由来するエナメル芽細胞株とは異なり、ヒトに近い高等哺乳類における細胞分化やエナメル形成の解析に適した研究材料となる。
以上の研究計画を進めるため、引きつづき細胞培養および器官培養は石川博客員教授が行い、培養組織や形成組織のエックス線学的解析は井出吉昭講師、病理組織学的解析は橋本尚詞教授、微細形態解析は立花利公教授、遺伝子発現解析および研究統括は研究代表者が行う。
加えて、エナメル芽細胞株の樹立実験は、富永徳子助教（日本歯科大学生命歯学部）を新たに研究分担者に加えて、細胞培養および解析の体制強化を図る。
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[Journal Article] The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines2015
Author(s)
Vandenhaute E, Stump-Guthier C, Lasierra Losada M, Tenenbaum T, Rudolph H, Ishikawa H, Schwerk C, Schroten H, Durken M, Marz M, Karremann M
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Journal Title
Cancer Cell Int
Volume: 15
Pages: 102-110
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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