2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of time-resolved spectroscopic systems with micro-flow devices and their application to the molecular mechanism of ABC transporters
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15H05476
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 時間分解計測 / ABCトランスポーター / マイクロ流路デバイス / 顕微分光測定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体分子あるいはその分子部分が『連動・協奏・相互作用』することによって実現される高次機能の分子機構解明を目指している。対象として、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターを選択し、その輸送・構造ダイナミクスを新規に開発する時間分解計測系によって観察し、①輸送を構成する化学反応の協約、②離合・集散を制御する分子間相互作用、③構造変化の連動性を明らかにする。本課題ではまず、①②に対応する以下の4種類の実験を行う。 1-1) ヘム輸送ダイナミクスを可視吸収分光計測、1-2) ATP結合/加水分解反応を赤外吸収分光計測、1-3) ABCトランスポーターのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測、1-4) ABCトランスポートシステムの離合・集散ダイナミクスを分子間FRET蛍光寿命計測によって明らかにする。また、③に関しては 2) ケージドATPを用いたシリアルフェムト秒X戦結晶構造解析によって明らかにする。
1) に関して、平成27・28年度には分子拡散型マイクロ流路ミキサーの新規設計・作製を行い、1-1)に利用する顕微型可視吸収装置および1-3), 1-4) に利用する蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置へ組み込み、その時間分解能の評価を行った。加えて、ヘムのABCトランスポーターであるBhuUV-Tの発現・精製系を構築し、BhuUVがヘムと結合したBhuTと特異的に結合すること、また加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。1-2) についてはケージドNOをモデル系として行い、紫外レーザーの光照射によるケージド化合物の光解離反応によって気質が放出され反応を誘起することに成功した。2)に関しては光反応によって反応が誘起される膜タンパク質の時間分解X線結晶構造解析に成功し、複数の雑誌にその結果を報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分子拡散型マイクロ流路ミキサーを用いた時間分解計測系の構築は順調に進んでいる。ミキサーの新規設計・作製を行い、顕微型可視吸収装置および蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置へ組み込み、その時間分解能の評価を行った。
加えて、時間分解X線結晶構造解析を行うための光励起システムの構築を行い、複数のタンパク質へと適用した。さらにその発展系である、ケージド化合物による反応誘起にも成功している。ケージド化合物を用いた系はケージド化合物さえ安定に作成されれば、さらに多くのタンパク質へと適用可能になる。
また、研究対象であるABCトランスポーターに関してはその発現・精製系を構築に成功しており、膜貫通ドメインを持つトランスポーターに対して、輸送基質と結合したペリプラズムタンパク質とが特異的に結合することを可視吸収測定によって初めて明らかにし、加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度は平成28年度から立ち上げた装置の性能評価を金属膜タンパク質への基質配位反応およびその酵素反応の実時間観察によって評価する。
また、コンフォメーション変化や離合・集散ダイナミクスを捉えるためには、FRETに加えて、スピンラベルESRによる、アミノ酸残基間距離測定を行える系の立ち上げを開始する。FRETでは2箇所に部位特異的傾向標識を行う必要があるが、平成28年度にそのような標識を行うと収量が極端に低下することを見出したので、スピンラベルで2箇所を同時に同一のラベルを行うことで収量の向上が見込まれるためである。
ATPの結合/加水分解反応、および加水分解後のADPおよびリン酸の脱離はミリ秒から秒のオーダーで起こることがBhuUVのATP加水分解活性測定からわかってきた。これらの反応を赤外吸収分光法によってマイクロ流路中で観察するためには平成27年度に完成させたフェムト秒赤外レーザーを光源に用いた時間分解赤外吸収測定系よりも10 um近くの回折限界に近い空間分解能をもつ SPring-8の赤外放射光の顕微鏡が最適である。平成28年度より、そのためのマイクロ流路ミキサーの再設計を開始しており、平成29年度はその組み込みとABCトランスポーターへの適用を推進する。
同様に、時間分解X線結晶構造解析においては、結晶中へのATPの拡散を行う必要があり、現在のケージド化合物を用いた系だけでは10ms以降の遅延時間を測定することは容易ではない。そこで、マイクロ流路ミキサーを用いた新たな実験系の立ち上げを行い、微結晶を含んだ溶液と基質となる分子を含んだ溶液を混合し、反応開始後10ms以降の時間点での結晶構造解析を行えるようにする。
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