2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of time-resolved spectroscopic systems with micro-flow devices and their application to the molecular mechanism of ABC transporters
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15H05476
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 時間分解計測 / ABCトランスポーター / マイクロ流路デバイス / 顕微分光測定 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体分子あるいはその分子部分が『連動・協奏・相互作用』することによって実現される高次機能の分子機構解明を目的とし、それに係る新規時間分解測定装置の開発と応用を行なった。
研究対象として、ATPを利用して小分子を細胞膜の一方から他方へと輸送する膜タンパク質であるABCトランスポーターを選択し、その輸送・構造ダイナミクスを新規に開発する時間分解計測系によって観察し、①輸送を構成する化学反応の共役、②離合・集散を制御する分子間相互作用、③構造変化の連動性、を明らかにする。①②に関して以下の4種類の実験を行うことを目標とした。1) ヘム輸送ダイナミクスを可視吸収分光計測、2) ATP結合/加水分解反応を赤外吸収分光計測、3) ABCトランスポーターのコンフォメーション変化を分子内FRET蛍光寿命計測、4) ABCトランスポートシステムの離合・集散ダイナミクスを分子間FRET蛍光寿命計測によって明らかにする。また、③に関しては 5) 時間分解シリアルフェムト秒X線結晶構造解析を行う。
平成29年度には、前年度までに作製した分子拡散型マイクロ流路ミキサーを利用した顕微型可視吸収装置 [1)]、顕微赤外分光装置 [2)]、蛍光顕微鏡・蛍光寿命計測装置 [3), 4)] を用いて、ヘムのABCトランスポーターであるBhuUV-Tに対して時間分解測定を行った。その結果、BhuUVがヘムと結合したBhuTと特異的に結合すること、また加水分解に伴って結合型の形成が促進されることを見出した。5) に関しては光反応によって反応が誘起される膜タンパク質の時間分解X線結晶構造解析に成功し、複数の雑誌にその結果を報告した。また、溶液混合を用いた新規時間分解X線結晶構造解析法の構築を進めた。BhuUV-Tに関する結晶化を試み、ヌクレオチド結合型は解析には成功しなかったが、微結晶化条件の最適化を行なった。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(15 results)
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[Journal Article] A nanosecond time-resolved XFEL analysis of structural changes associated with CO release from Cytochrome c Oxidase2017
Author(s)
Atsuhiro SHIMADA†, Minoru KUBO†, Seiki BABA†, Keitaro YAMASHITA, Kunio HIRATA, Go UENO, Takashi NOMURA, Tetsunari KIMURA, (他18名), Hideo AGO*, Shinya YOSHIKAWA*, Tomitake TSUKIHARA* (†These authors contributed equally to this work.)
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Journal Title
Science Adv.
Volume: 3
Pages: e1603042
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Capturing an Initial Intermediate during the P450nor Enzymatic Reaction using Time-Resolved XFEL Crystallography and Caged-Substrate2017
Author(s)
Takehiko TOSHA†, Takashi NOMURA†, Takuma NISHIDA†, Naoya SAEKI, Kouta OKUBAYASHI, Raika YAMAGIWA, Michihiro SUGAHARA, Takanori NAKANE, Keitaro YAMASHITA, Kunio HIRATA, Go UENO, Tetsunari KIMURA, (他20名), Hiroshi SUGIMOTO*, Yoshitsugu SHIRO*, Minoru KUBO* (†These authors contributed equally to this work.)
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Journal Title
Nat. Commun.
Volume: 8
Pages: 1585
DOI
Peer Reviewed
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