2017 Fiscal Year Annual Research Report
Catalytic protein labeling on nano meter scale and its application to the analysis of intracellular protein structure
| Project/Area Number |
15H05490
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
佐藤 伸一 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (20633134)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | タンパク質ラベリング / 反応空間制御 / 触媒‐近接標識 / 部位特異的修飾 / タンパク質複合体解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質1分子の大きさはおおよそ5～10 nmであり、タンパク質‐タンパク質相互作用におけるタンパク質間の距離を考慮すると、触媒から数nmの距離で完結する反応は、“タンパク質の部位特異的ラベル化”に応用できる。また、触媒から数十nm以上の反応有効空間を達成することで、“タンパク質の会合状態を検出する方法”の発展に直結する。
平成29年度までの成果で、以下の項目を達成している。
1．触媒から数nmの近接ラベル化のラベル化特性の精査と応用：Ru錯体とTyr残基を種々の長さのリンカーで連結したペプチドを用いて、種々のタンパク質ラベル化剤の特性を評価してきた。その過程で特定の化合物構造が、触媒から数nmの有効範囲内で、効率的に機能すること、一電子酸化的・ラジカル的に活性化されたラベル化剤のラジカル寿命とラベル化有効距離が相関することを明らかにした。また、リガンド連結型のRu光触媒を用いて、新たに見出したラベル化剤でのタンパク質ラベル化を行ったところ、タンパク質混在系でリガンド結合タンパク質を従来法よりも高選択的にラベル化することに成功した。
2．細胞内で機能するラジカル的なタンパク質ラベル化とタンパク質間相互作用への応用：これまで一電子酸化触媒として用いてきたRu錯体は2+のカチオン性構造による細胞膜透過性の低さが課題で細胞内のタンパク質ラベル化への適用は困難であった。そこで、一電子酸化触媒として機能しうる種々の低分子や遺伝子工学的手法による酵素の導入を検討し、細胞内でも機能する触媒‐ラベル化剤の組み合わせを数種見出すことに成功した。
3．タンパク質の三次元構造に立脚した部位特的タンパク質ラベル化法の応用：一電子酸化的なタンパク質ラベル化を研究する過程で、タンパク質構造中の表面に露出したチロシン残基を選択的にラベル化できることを発見した。この概念により、抗体の機能を保持したまま部位特異的ラベル化することに成功した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1．触媒から数nmの近接ラベル化のラベル化特性の精査と応用：本課題の初年度から合成しているRu錯体－【剛直なpoly Pro linker】－Tyr残基のペプチドを基質として種々のレドックス応答活性を持つ化合物を評価することで、Tyr残基ラベル化剤として機能しうるラベル化剤構造とそのproximity labeling特性を精査した。その過程で触媒の近傍空間でのみ機能するラベル化剤(1-Methyl-4-aryl-urea: MAUra)構造を見出した。MAUraをラベル化剤に用いることで、リガンド連結型一電子酸化触媒の標的タンパク質ラベル化における、標的選択性とラベル化効率の向上に成功した。
2．細胞内で機能するラジカル的なタンパク質ラベル化とタンパク質間相互作用への応用：一電子酸化触媒を細胞内に送達し、その周辺でproximity labelingを制御することで、タンパク質相互作用解析の新規ツールを開発することを目的としている。昨年度までは細胞内へのperoxidaseタグ発現（APEX2）等を検討し、細胞内で機能するラベル化反応を検討していたが、本年度ではそれに加えて、Ru光触媒以外の一電子酸化特性を示す低分子構造を検討した。その結果、良好な細胞膜透過性とタンパク質ラベル化特性を併せ持つ触媒構造が示唆されている。
3．タンパク質の三次元構造に立脚した部位特的タンパク質ラベル化法の応用：一電子酸化的なタンパク質ラベル化を研究する過程で、タンパク質構造中の表面に露出したチロシン残基を選択的にラベル化できることを発見した。抗体に本手法を適用したところ、当初の想定以上に特定のチロシン残基が特異的にラベル化されること、ラベル化された抗体は抗原結合能を保持していること、動物実験モデルにおいても良好なターゲット集積性をしめすことを明らかにした。
|
| Strategy for Future Research Activity |
最終年度の研究目標として当初の目標通り、「I．細胞内でのラジカル的なタンパク質ラベル化による細胞内の複合体タンパク質解析」に関する研究を遂行する。加えて、平成29年度に新たに見出した「II. ラジカル反応による抗体の新規部位特異的ラベル化技術の開発」を進める。
I．細胞内でのラジカル的なタンパク質ラベル化による細胞内の複合体タンパク質解析：既に、遺伝子工学的な実験手法により、一電子酸化触媒として機能する低分子を任意・特定の細胞にのみ結合させる実験手法を確立している。そこで、これまで蓄積してきたタンパク質ラベル化剤の構造機能性相関情報を基に、細胞内環境で機能するタンパク質ラベル化法に関して、タンパク質複合体解析に最適なラベル化有効距離とラベル化効率を示す「触媒構造×ラベル化剤構造」の組み合わせを細胞内のタンパク質ラベル化実験により選定する。同時に、特定の解析対象タンパク質と複合体を形成する相互作用パートナータンパク質を同定する。具体的には、ビオチン結合ラベル化剤によりラベル化、濃縮、質量分析により解析する。
II. ラジカル反応による抗体の新規部位特異的ラベル化技術の開発：平成29年度に見出した「ラジカル反応を利用した抗体の部位特異的ラベル化法」の知見は薬物抗体複合体の新規作成技術や抗体ベースのバイオマテリアル創出に重要であるため、これらの応用研究を今後展開する。細胞外の実験系においては研究開始からこれまでに、様々なラベル化条件（触媒、ラベル化剤や反応活性化刺激の種類）を見出している。そこで、これまでの知見を踏襲して、より効率的かつ部位特異的に抗体をラベル化する反応条件を見出す。また、ラベル化抗体について、血中安定性や腫瘍蓄積性を検証する。
|
