核内蛋白質によるヌクレオソーム認識機構の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H05587
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 加藤 秀典 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任准教授 (30630850)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヌクレオソーム

Outline of Annual Research Achievements

真核生物のDNAはコンパクトなクロマチン構造を形成して、核内に収納されている。クロマチンの基本構成単位がヌクレオソームであり、本研究では様々な核内蛋白質によるヌクレオソーム認識機構を明らかにすることを目的にしている。
今年度は、ヌクレオソームに特異的に結合する蛋白質を数多く見出し、等温滴定型熱量計によってアフィニティを定量的に評価した。また、変異体を用いることにより、ヌクレオソームのどの部位を認識しているのかを明らかにした。
さらに、それらの中から構造解析に適したものを選び、溶液NMRによって詳細な結合部位を決定した。また、複合体の結晶化を行ったところ、5オングストローム程度の分解能の結晶を得ることに成功した。
さらに、相互作用の生物学的意義を明らかにするため、培養細胞を用いた実験を行った。その結果、複数の蛋白質において、in vitroで見出したヌクレオソームへの結合がin vivoにおいても起こっていることを示すデータが得られた。現在、生物学的機能を詳細に明らかにするために、表現型解析を行っている。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

初年度に計画していた「ヌクレオソームに特異的に結合する蛋白質の同定」は順調に進み、数多くの新規ヌクレオソーム結合蛋白質を見出すことに成功した。これらの因子について、等温滴定型熱量計を用いてアフィニティを定量的に評価した。また、変異体を用いた測定によって、ヌクレオソームのどの部位を認識するのかを明らかにした。
研究が当初の予定を上回るペースで進捗したため、2年目以降に予定していた構造解析にも着手し、溶液NMRによって詳細な結合部位を決定することに成功した。さらに、複合体の結晶化を行い、、現在までに5オングストローム程度の分解能の結晶を得ることに成功している。
さらに、当初の研究計画になかった培養細胞を用いた実験も行い、ヌクレオソームへの結合が生体内において起こっていることを、複数の蛋白質で示すことに成功した。現在、相互作用の生物学的機能を調べるため、表現型解析を行っている。

Strategy for Future Research Activity

研究は当初の計画以上に進展しており、今年度は１）複合体の構造解析、２）機能解析、３）リン酸化による制御、の３点に絞って研究を進める。
１）については構造解析に適していると思われる安定な複合体を見出しており、それらについて結晶化を行う。
２）については、in vitroアッセイや培養細胞を用いた実験を行い、ヌクレオソームへの結合が生体内においても起こっていること、実際に重要な生物学的機能を担っていることを明らかにする。
３)については、in vitroのキナーゼアッサイを行う予定である。