2016 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of molecular mechanism of skin barrier formation by acylceramide.
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15H05589
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大野 祐介 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (50611498)
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2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | セラミド / 皮膚 / アシルセラミド / 脂肪酸 / 魚鱗癬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
皮膚は体内の水分の損失の防止や外来微生物および化学物質の侵入防止の透過性バリアとして作用する。このバリア機能の本体は脂質であり，その中でも特には表皮特異的に存在するアシルセラミドは，皮膚のバリア形成に必須である。アシルセラミドは，1980年代に構造決定がなされたが，その合成経路は不明であった。前年度までに，アシルセラミドが，脂肪酸伸長酵素ELOVL4による脂肪酸の伸長（超長鎖脂肪酸の合成），脂肪酸ω水酸化酵素CYP4F22による超長鎖脂肪酸のω水酸化，セラミド合成酵素CERS3によるω水酸化超長鎖脂肪酸アシルCoAと長鎖塩基の縮合（ω水酸化セラミドの合成），ω水酸化セラミドへのリノール酸の付加反応を経て合成されることを明らかにし，リノール酸の付加反応を魚鱗癬原因遺伝子産物PNPLA1が触媒することを見出したが，その詳細な触媒機構は不明であった。
2016年度は，in vitroにおけるPNPLA1のアシルセラミド合成活性解析系の確立に成功し，PNPLA1はリノール酸含有トリグリセリド（TG）のリノール酸をω水酸化セラミドに直接転移することでアシルセラミド合成を担うトランスアシラーゼであることを明らかにした。またPNPLA1遺伝子の魚鱗癬変異体（A34T, A59V，E131）ではアシルセラミド活性が顕著に低下または消失していることを明らかにし，PNPLA1遺伝子変異とアシルセラミド合成活性，魚鱗癬発症がそれぞれ相関することを見出した。また，機能未知の魚鱗癬原因遺伝子Ichthyinノックアウトマウスの作製に成功し，ノックアウトマウスは新生致死となることを見出した。Ichthyinノックアウトマウスの致死の原因は，アシルセラミド量の減少および皮膚バリア機能が低下しているためであることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アシルセラミドは分化が進んだ表皮の細胞といった限られた細胞でしか合成されないため，その合成に関与する酵素を同定は困難であった。これまでに研究代表者は，通常の培養細胞を用いたアシルセラミド合成解析系の確立に成功していたが，それに加えて2016年度はプロテオリポソームを用いたアシルセラミド合成活性解析系を確立することに成功した。その結果，2016年度ではこれまで不明であったアシルセラミド合成の詳細な分子メカニズムの解明，特にPNPLA1がトランスアシラーゼ活性によりアシルセラミド合成におけるリノール酸付加反応を担っていることを明らかにすることに成功した。これらの結果をまとめ，論文を投稿，受理に至っている（Nature Communications, 8, 14610）また，機能未知の魚鱗癬原因遺伝子Ichthyinノックアウトマウスに関しても，ノックアウトマウスで新生致死となることを見出すことができたため，当初の計画通りに研究が進行しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
機能未知の魚鱗癬原因遺伝子産物PNPLA1がアシルセラミド合成を行なうトランスアシラーゼであることが明らかになったことは，アシルセラミド合成に最低限必要な酵素がほぼすべて同定され，アシルセラミド合成に至る反応経路が明らかになったことを意味する。しかし，未だ機能未知の魚鱗癬原因遺伝子や魚鱗癬発症メカニズムが明らかになっていない魚鱗癬原因遺伝子も存在し，中にはアシルセラミド合成への関与が示唆されるものも存在する。機能未知遺伝子Ichthyinノックアウトマウスで皮膚バリア機能低下により新生致死となることを見出したが，Ichthyinノックアウトマウスが致死となるメカニズムおよびIchthyinの機能解明には至っていない。Ichthyinノックアウトマウスでアシルセラミド合成が低下したという結果は，Ichthyinがアシルセラミド合成の調節に関与している可能性も考えられる。そこで2017年度はIchthyinノックアウトマウスの表皮の形態解析（H&E染色および電子顕微鏡観察），発現変動解析，初代培養ケラチノサイトを用いた3次元培養における形態解析，脂質解析を行なうことで，Ichthyinの機能の解明を目指す。また，機能未知の魚鱗癬原因遺伝子LIPN，魚鱗癬症候群原因遺伝子ABHD5およびACSVL4の変異による魚鱗癬発症メカニズムは明らかになっていない。そのため，2017年度はこれらがアシルセラミド合成へ関与するかどうかに関しても，これまでに構築したアシルセラミド合成活性解析系を用いて明らかにしていく。
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