2016 Fiscal Year Annual Research Report
改造して理解するモータータンパク質F1-ATPaseの動作原理
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15H05592
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
古賀 信康 分子科学研究所, 協奏分子システム研究センター, 准教授 (50432571)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質分子デザイン / 分子モーター / F1-ATPase / 改造 / 構造変化 / 分子シミュレーション / 計算機デザイン / 生化学実験 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、計算機と生化学実験、両方の手段を用いて合理的にATPをエネルギー源として駆動する回転モータータンパク質F1-ATPaseを改造することにより、その動作原理を明らかにすることを目的とする。F1-ATPaseはαおよびβサブユニットが交互に３つずつ並んだ６量体のリング構造を形成し、リング中心を回転子であるγサブユニットが貫いている。３つのβサブユニットが協同しながら順番にATPと結合・加水分解を行うことにより、自身の構造を大きく変化させ、γサブユニットを回転させている。αおよびβサブユニットは配列および構造が良く似ており、どちらもP-loop (GxxxxGKT/S)と呼ばれるリン酸結合部位を持つ。しかしながら、βサブユニットはATPを加水分解してOpen-Closedの構造変化を示すのに対し、αサブユニットはATPを結合するのみでClosedのままである。βサブユニット構造中に、ATP加水分解とそれに伴う構造変化の仕組みはどのように組み込まれているのだろうか？当該年度は、βサブユニットの構造変化能の仕組みを明らかにすることを目的として、βサブユニットのATP結合における構造変化能を無くすよう改造を行った。まず、αおよびβサブユニットの結晶構造を比較することにより、構造変化に重要であると考えられる部位を探索した。その結果、P-loopのxxxxに対応する残基の違いのためにαのP-loopは構造変化ができないことが示唆された。そこで、βのP-loopにおいてそれらの残基をαのものに変異したときの構造変化能に及ぼす影響を、分子シミュレーション、１分子回転計測実験等を用いて調べた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ATP結合に伴って構造変化を起こすβサブユニットと、ATPを結合するが構造変化能を有しないαサブユニットの結晶構造を比較することにより、構造変化の源とも言えるP-loopの構造変化に重要な部位を特定した。そして、それに基づいて、タンパク質分子デザインソフトウェアRosettaやFolditを用いて、計算機上で、βサブユニットのP-loopの残基をαのものに変異させ、その構築したモデルを用いて分子動力学シミュレーションを行うことにより、その変異が構造変化能に及ぼす影響を調べた。また、大腸菌でその変異タンパク質を発現・精製し、１分子回転計測実験や様々な生化学実験を行うことにより、その変異がβサブユニットの構造変化、ひいてはF1-ATPaseの回転に与える影響を調べた。全体としては研究はおおむね順調に進んでいるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、βサブユニットのP-loopの構造変化に重要であると思われる部位の変異が構造変化能に及ぼす影響を、分子動力学シミュレーション、生化学実験、１分子回転計測実験等を用いて詳細に検証する。特に、トリプトファンの蛍光変化、X線小角散乱等を用いてβサブユニット単体の構造変化を検出する方法を開発することにより、βサブユニットが構造変化しているかどうかを検証する。最終的には、X線結晶構造解析等を行うことにより検証を行う。また、P-loop以外の場所で構造変化に重要であると思われる部位（以前に同定されたシーソーモチーフを含む）についても改造を行うことにより、それらの改造が構造変化能に及ぼす影響を検証する。このようにして、βサブユニット構造中に組み込まれている構造変化の仕組みを解明する。構造変化の仕組みが明らかになったら、その仕組みをαサブユニットに組み込むことにより、αサブユニットに構造変化能を付与する。構造変化能の改造に成功した後には、ATP加水分解能の改造を行い、ATP加水分解、構造変化がどのようにカップルしてF1-ATPaseを回転させているのか、その動作原理の解明を目指す。
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Research Products
(3 results)
