2017 Fiscal Year Annual Research Report
一次繊毛関連因子により構築される細胞周期監視システムの新展開
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15H05596
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
千葉 秀平 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (60572493)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 一次繊毛 / 基底小体 / 中心体構造変換 / 細胞周期 / チェックポイント / 多繊毛細胞 / 超解像度顕微鏡 / Appendage |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小管重合中心である中心体は分裂期では紡錘体の極、休止期では一次繊毛の土台である基底小体として細胞周期の各段階に応じて機能を変化させる。細胞周期と同調した中心体の柔軟な機能変化がいかなる分子システムによって担われているかは詳しくわかっていない。申請者は、一次繊毛形成の際に中心体から基底小体への変換に関わる因子が増殖相進行中には意外なことに中心体外で細胞周期の進行を監視する機能を保持している可能性を見出した。本研究は、この”非繊毛機能”と”中心体構造変換”の 二役を一手に担う蛋白質群の発見をもとに、細胞周期と密接な同調性をもつ中心体の機能ならびに構造変換の分子基盤を世界に先駆けて明示することが目的である。
本年度は前年度に引き続き、Appendageタンパク質の発現抑制または機能抑制による細胞周期進行への影響の解析に着手した。解析にあたって、解析対象となるAppendageタンパク質の細胞周期制御機能を詳細に解析する目的で、細胞周期進行可視化プローブであるFucciの安定形質発現細胞株、ならびに細胞周期制御因子であるCDK2の活性を生細胞でモニタリングする蛍光プローブを安定的に発現させた細胞株をCRISPR-Cas9システムを基盤とするゲノム編集技術により構築した。これにより、対象因子の機能抑制による細胞周期制御異常を迅速に把握できるようになった。また、計画案で提示したマウス気管上皮の初代培養システム(mTEC)を用いた中心体構造変化の解析は、当初予定していた超解像度顕微鏡技術に加えて、試料物理的超解像度技術を併用することで飛躍的な分解能の向上を達成することに成功した。この結果、中心体構造変換機構についてより詳細なイメージングが可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. Appendage複合体の核内集積とその動態変化の解析: 蛍光を付加したAppendage構成因子を安定的に発現する安定形質発現細胞株を作製し、それぞれの因子が核内集積に至るまでの動態変化について経時的な観察を行った。この結果、一部のAppendage構成タンパク質については、DNAダメージ依存的な核内集積をみとめた。
2. Appendage複合体の核内集積調節機構の解析: Appendageタンパク質の核内集積を調節する機構として、既知のDNAダメージ修復関連キナーゼによるAppendageタンパク質のリン酸化がAppendageタンパク質の核内への集積に関与する可能性を見出した。
3. Appendageタンパク質の発現抑制または機能抑制による細胞周期進行への影響の解析: 細胞周期進行可視化プローブであるFucciの安定形質発現細胞株ならびに細胞周期制御因子であるCDK2の活性をモニタリングするプローブを安定的に発現させた細胞株を構築し、Appendage欠損細胞の機能抑制による細胞周期制御異常について迅速かつ正確に把握することが可能となった。
4. 中心体構造変換の可視化: 超解像度顕微鏡技術と試料物理的超解像度技術の併用により、光学限界が障害となって解析が困難であった中心体構造変換過程での対象因子の中心体上での分子の配向について詳細に解析することが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
該当年度ではこれまでの成果により得られる概念の拡充を目指し、ODF2, FBF1, CEP83, SCLT1, Cep89, Cep19などの既知Appendage構成蛋白質をはじめ、その他の中心体・繊毛構築関連因子についてもDNA損傷修復への関与を検証する。また、DNA損傷修復関連因子には中心体への局在が報告されているものの、中心体構造変換における寄与については不明なものが多い。これら因子の機能実態を検証する目的で、核膜崩壊を前提としない中心体構造変換を起こすmTec培養系への対象因子の発現抑制系の構築や各種阻害剤の投与により、これら因子の中心体構造変換に与える影響を検証していく。
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