2015 Fiscal Year Annual Research Report
クロロフィル二次代謝産物を新規指標とした海洋の微細藻類食プロティストの生態の解明
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15H05607
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| Research Institution | Fukui University of Technology |
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Principal Investigator |
柏山 祐一郎 福井工業大学, 環境情報学部, 准教授 (00611782)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | クロロフィル / 水圏環境 / プロティスト / 微細藻類 / 光毒性 / シクロエノール / シクロフェオフォルバイドエノール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず，昨年度の航海（調査船よこすかYK14-12航海；本研究の予備検討）で得られていた三陸沖の北太平洋の外洋の表層水試料を用いて，懸濁物の化学分析と微細藻類を捕食する候補生物の分離培養を試みた。すなわち，有光層内の表層海水の懸濁物の濾過試料からは，微子藻類に起因すると考えられるクロロフィル類（Chl-a，b,，およびc類）に加えて，プロティストによるそれら微細藻類の捕食を示唆するシクロエノール類（132,173-Cyclopheophorbide a enol［cPPB-aE］および132,173-Cyclopheophorbide b enol［cPPB-bE］）が検出された。これらの比率は採水深度によって優位に変化し，現場における捕食プロセスとの関連づけた議論が可能であると考えられた。また，実験室で海水試料にChl-dを産生するAcaryochloris marinaを添加したところ，顕微鏡下で微細な鞭毛虫類やアメーバ類などのプロティストによる捕食が観察されたことに加えて，未知のクロリン化合物が検出された。培養系内でChl-dのみが基質たりうること，cPPB-aEやcPPB-bEと同様なSoret帯の複雑化やQy帯の大きなred shiftなどから，この化合物は13(2),17(3)-Cyclopheophorbide d enol［cPPB-dE］であると考えられた。そこでこの化合物の標準試料を合成して化学構造を確認し，新規化合物であることを確かめた。
次に，三重大学の練習船勢水丸SE1525航海（2015年）で海洋表層水を層別採水し，微細なピコ藻類捕食性のプロティストの分離を試みた。これまでに，バクテリアを捕食する二本鞭毛虫（Developayella sp.）や浮遊性のアメーバなどの分離株を作成した。現在，これら試料を用いて微細藻類の捕食実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は，新しい分析装置の導入（HPLC-MS/MS）とその分析系の立ち上げがひとつの大きな課題であった。残念ながら減額の影響で，当初予定していたフルセットを年度内にそろえることは困難であったが，価格交渉により，なんとか，本研究課題にどうしても不可欠な装置の主要部分を購入し，不完全な状況ではあるものの分析をおこなえる状況にこぎ着けた。これに関しては，平成28年度の予算で残りの必要モジュールを買い足して，完全な形で分析の系を立ち上げられる見通しが立った。
一方で，海洋調査から得られた試料を用いて，ピコ藻類を人為的に与えることで，捕食が行われることを顕微鏡下の観察で明らかにした。また，捕食により生じると考えられるクロロフィルの代謝産物であるシクロエノール類を色素分析により確認できたことで，これを量的に評価する手がかりを得た。また，これらの実験や環境試料の定量分析で必要不可欠である2種類のシクロエノール類を合成することに成功した（ともに新規化合物）。また，上述の観察で確認された，微細藻類を捕食しうる様々な微少な無色鞭毛虫類を複数分離し，単離培養することに成功した。一部については，遺伝系統解析を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度年度において外洋の表層水から分離した様々な無色プロティストを用いて，Chl-dを産生するAcaryochloris marina，およびジビニルクロロフィル類（DV-Chl-aなど）を産生するProchlorococcus marinusを捕食させ，どのようなクロロフィル代謝産物がみられるかを調べる。特に，外洋の研究で重要となるジビニルクロロフィル類から作られると予想される3,8-divinyl-13(2),17(3)-cyclopheophorbide a/b enol［DV-cPPB-aE/bE］に着目し，P. marunusの捕食に関する定量評価を試みる。
一方，平成28年度の予算を用いて，昨年度導入したHPLC-MS/MSにAPCIインターフェースを追加することで，環状テトラピロール型のクロロフィル誘導体（クロロフィル類とシクロエノール類を含む）を分析する系を立ち上げる。移動相の工夫により，シクロエノール類を含むクロロフィル代謝物すべてを定量的かつ迅速・高感度で分析する方法を確立し，微少スケールの実験試料や，生物存在量の非常に小さい遠洋域の海水試料の分析を進める。
さらに，平成28年度および29年度の練習船勢水丸（三重大学）の調査航海に参加し，熊野灘沖の太平洋黒潮海域において表層水の層別採水をおこない，（１）色素分析，（２）メタゲノム解析，および（３）無色プロティストの単離・培養とそれらを用いた捕食実験を進める。色素分析においては，抽出効率と抽出物の安定性に関連して，様々な抽出法を試みる。
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[Presentation] Chlorophyll catabolism generating cyclopheophorbide enols generated by autotrophic and heterotrophic euglenoids2015
Author(s)
Y. Kashiyama, J. Kawahara, M. Maruyama, T. Suzaki, M. Nakazawa, T. Ishikawa, A. Yamaguchi, A. Yabuki, A. Uzuka, S. Miyagishima, T. Shiratori, A. Kawaguchi, A. Yokoyama, H. Tamiaki
Organizer
VII European Congress of Protistology
Place of Presentation
Seville, Spain
Year and Date
2015-09-05 – 2015-09-10
Int'l Joint Research
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