2016 Fiscal Year Annual Research Report
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15H05616
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小西 美稲子 東京大学, 生物生産工学研究センター, 特任助教 (20642341)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 植物栄養 / 硝酸シグナル応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の硝酸シグナルに応答した遺伝子発現を担うNLP転写因子は、硝酸シグナルによってリン酸化され活性型となる。共同研究により、NLPのリン酸化にはカルシウムイオンが必要であること、そしてカルシウム依存性リン酸化酵素がNLPをリン酸化することを明らかにした。
さらにNLPの作用機作をより明らかにするために、スクリーニングにより同定された相互作用因子の解析を進めた。まず、転写制御に関わる可能性のあるSETドメインを持つタンパク質とNLP6/NLP7との相互作用を共免疫沈降法によって解析したところ、結合が検出された。そこで、この因子の過剰発現体とT-DNA変異体の両方を用いて硝酸応答性遺伝子発現を解析したが、野生型との違いは見られなかった。したがってこの因子とNLPとの相互作用は硝酸応答性遺伝子発現に直接に影響するものではないと考えられた。次に、NLPのPB1ドメイン間の相互作用について解析を行った。まずY2H系を用いてシロイヌナズナNLPのPB1ドメイン同士の相互作用を網羅的に解析した。その結果、多くの組み合わせで相互作用が検出されたことから、PB1ドメインを介したNLPの多量体化が普遍的におきている可能性が示唆された。そこでNLP6とNLP7のPB1ドメインを欠損させたコンストラクトを作成し、一過的発現系を用いて、PB1ドメインがNLPによる遺伝子発現制御に及ぼす効果を検討した。その結果、幾つかの遺伝子のプロモーターでは、NLP6/NLP7による活性化がPB1ドメインの欠損により弱まることが分かった。一方、PB1の欠損がほとんど影響しない遺伝子プロモーターもあった。さらにPB1ドメイン自身には転写活性化能を持たないことも示されたことから、PB1ドメインを介したNLP間の相互作用が、NLP標的遺伝子の一部の発現を最大化するのに必要である可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
共同研究により、NLPの活性化を制御する因子として、硝酸シグナルに応答してNLPをリン酸化するカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素の同定に成功した。これにより、硝酸シグナルによるNLP活性化の主要な経路のひとつを明らかにすることができた。またこの解析結果から、カルシウム非依存性の経路も必要である可能性が新たに示唆された。NLPの他の相互作用因子についても、酵母細胞を用いたスクリーニングで得られた候補が実際に植物細胞内でNLPと相互作用していることが確認できており、NLPの作用機構の解明に向けて順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
硝酸シグナルに応答したNLPのリン酸化は、カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素によるものであることを明らかにしたが、細胞内カルシウム濃度の上昇やカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素の強制的活性化のみでは硝酸応答性遺伝子発現が起こらないことから、Ca2+シグナリングの上流で分岐する別の経路の存在が想定された。この機構を明らかにするために、引き続きNLPタンパク質のドメイン解析と相互作用因子の解析を進める。
NLP6の核外輸送配列の同定についは、現在見られている細胞質への局在が、厳密に核外輸送の定義に合致したものであるか確認する必要がある。すなわち、(1)タンパク質の分解産物によるアーティファクトでないこと、(2)核外輸送の 阻害剤を用いて核内へ完全に輸送されていること、などを調べる。その上で、核外輸送を担う領域をさらに狭め、必要十分なアミノ酸配列を決定する。またさらに同定したNLP6のアミノ酸配列と、真核生物において核外輸送を担うとされている因子との相互作用を調べる。また、Y2Hスクリーニングで得られた核膜孔複合体因子との相互作用も解析する。
酵母を用いた実験から、NLPのC末端に位置するPB1ドメイン同士が相互作用しうることを見出した。そして、PB1ドメインが一部のNLP標的遺伝子の活性化に関与しているという手がかりが得られたので、この点を中心に解析を進めていく。nlp変異体にPB1ドメイン変異型NLPを発現させるコンストラクトを導入し、野生型NLPのコンストラクトを導入して相補させた場合と比較を行う。具体的には表現型解析とマイクロアレイ解析を行って、PB1ドメインが関与する標的遺伝子と表現型を同定する。
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