2015 Fiscal Year Annual Research Report
複合微生物系におけるプラスミドの「真の」宿主域の解明
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15H05618
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
新谷 政己 静岡大学, 工学部, 准教授 (20572647)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | プラスミド / 宿主 / 嫌気性細菌 / 複合微生物系 / 接合伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.微好気・嫌気条件下で接合伝達可能なプラスミドの探索
好気条件下で蛍光を示すGFPを発現する受容菌を利用して，環境試料より接合伝達性の薬剤耐性プラスミドの探索・取得を試みたところ，異なるプラスミドをもつと推定される169コロニーを取得することに成功した．得られたプラスミドの種類を調べたところ，少なくともIncP-1群プラスミドの他にPromAに属するプラスミドを得られたことが示唆された．現在本システムを利用して，嫌気チャンバー・嫌気培養システム内で，微好気・嫌気条件下でもプラスミドを探索可能か検証している．一方，GFPは酸素の存在下でしか蛍光を示さないため，酸素を必要としないFbFPの遺伝子を受容菌の染色体内に挿入した．その過程で，FbFPは宿主の種類によって蛍光強度が大きく異なることが判明した．このため，当該タンパク質は，プラスミドの宿主域の調査には適していないことが示唆された．
2.微好気・嫌気条件下におけるプラスミドの接合伝達現象の検出・分離法の確立
蛍光タンパク質を利用した接合完了体の検出法は，タンパク質発現の可否や，蛍光強度の違いによるバイアスを受けるため，タンパク質発現に依存せずに，低コピーのプラスミドを検出可能なPlasmid-FISH法を並行して行った．しかし，培養した細菌細胞内のプラスミドDNAの検出には成功したものの，環境試料中の微生物は，細胞サイズが小さく，また試料中に蛍光を示す夾雑物が混入してバックグラウンドが高くなり，もともと低コピーのプラスミドDNAを検出するのが難しいことが示唆された．現在，既存のPlasmid-FISHの改良を試みている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定では，既存のプラスミドについて，微好気・嫌気条件下における接合伝達の可否について調べる予定であったが，嫌気システムの導入と，嫌気条件下での平板培地作製にやや時間を要し，検証に至っていない．また，蛍光タンパク質を利用した伝達の検出についても，宿主ごとの蛍光強度の違いが大きく，抗生物質や，FISH法を利用した手法に切り替える必要があると判明した．いずれも前年度中に問題解決や方針変更に至っており，本年度中には当初計画した微好気・嫌気条件下におけるプラスミド伝播現象の追跡と宿主域の決定法の確立まで到達できると考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
1.微好気・嫌気条件下で接合伝達可能なプラスミドの探索
前年度，好気条件下で既に導入に成功しており，引き続き土壌や嫌気発酵槽内のグラニュール等よりプラスミドの収集を試みるとともに，微好気・嫌気条件下においても収集を行う．また，既存のプラスミドについては，微好気・嫌気条件下でのプラスミドの伝播の可否について，前年度までに導入した，嫌気培養システムの下，抗生物質耐性を指標に検証する．
2.微好気・嫌気条件下におけるプラスミドの接合伝達現象の検出・分離法の確立
前年度までに，微好気・嫌気環境におけるプラスミドの伝播に使用した蛍光タンパク質FbFPは，GFPよりも蛍光強度が低く，また宿主ごとに示す蛍光強度が異なったことから，本課題の目的には適さないと判断した．そこで，当該タンパク質を利用した検出ではなく，DNA自体を検出する手法の確立を目指すこととした．プラスミドDNA自体を検出するために，「国際共同研究強化」の課題と合わせて既存のFISH法の感度と精度をより良いものにする．
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities2016
Author(s)
Kosuke Yanagida, Ayako Sakuda, Chiho Suzuki-Minakuchi, Masaki Shintani, Kazuhiro Matsui, Kazunori Okada, Hideaki Nojiri
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Journal Title
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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