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2016 Fiscal Year Annual Research Report

複合微生物系におけるプラスミドの「真の」宿主域の解明

Research Project

Project/Area Number 15H05618
Research InstitutionShizuoka University

Principal Investigator

新谷 政己  静岡大学, 工学部, 准教授 (20572647)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords宿主 / 嫌気性細菌 / 複合微生物系 / 接合伝達 / GFP
Outline of Annual Research Achievements

1.微好気・嫌気条件下で接合伝達可能なプラスミドの探索
GFPを発現する受容菌を利用して,環境試料より接合伝達性の薬剤耐性プラスミドの探索・取得を試みてきた.これまでに嫌気発酵槽内の汚泥や牛糞試料よりIncP-1群・PromA群に属すると推定されるプラスミドを得ることに成功し, 3つのプラスミドについて全塩基配列を決定した.特にPromAに属するプラスミドについては,新規性が高いことが示唆された.
2.微好気・嫌気条件下におけるプラスミドの接合伝達現象の検出・分離法の確立
当初計画していた嫌気条件下で蛍光を示すタンパク質(FbFP)の利用が本研究の目的に必ずしも適していないことが判明したため,再度GFPの利用を試みた.嫌気条件下の接合実験後,短時間酸素に曝すことでGFPの蛍光の検出を試みた結果,嫌気条件下で形成させた接合完了体のコロニーが,好気条件下に移して数時間で蛍光を示すことが判明した.この性質を利用して,モデルプラスミドpBP136::gfpについて,絶対好気性細菌のPseudomonas putidaをpBP136::gfp の供与菌とし,通性嫌気性細菌のPantoea属,Buttiauxella 属,Pseudomonas stutzeri株を受容菌として接合実験を行った.結果として,プラスミドは嫌気条件下でいずれの受容菌にも伝達することが示され,その伝達頻度は好気条件下よりも1/100-1/1000程度低いことが判明した.
上述した方法を利用して,pBP136::gfpの供与菌を,環境中の複合微生物集団と混合して,嫌気チャンバー内で接合実験を行った結果,接合完了体を得ることに成功した.プラスミドを有する細胞を検出するplasmid-FISH法については,科研費の国際共同研究強化の課題と連携して,その精度と確度を高める実験を開始した.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究開始年度,当初予定していた蛍光タンパク質が,本研究の目的に適していないことが判明したために,既存のプラスミドについて,嫌気条件下で接合伝達するかどうかの検証ができていなかった.このため,2年目開始時には,当初計画よりやや遅れているとしたが,GFPを利用した実験が可能であることが示され,実際に嫌気条件下でのプラスミド伝播を検出し,その頻度を測定することに成功した.また嫌気条件下で,プラスミドが複合微生物系内のどの微生物に伝播するのか明らかにすることも可能になり,その宿主域を決定するための見通しが立ったと考えている.これらの手法は,GFPの発現に依存しているため,バイアスが大きいと考えられるが,プラスミドDNAを直接検出するplasmid-FISHについても確立に向けて,段階的に実験を行っており,当初の計画通り順調に進んでいると考えている.

Strategy for Future Research Activity

1.嫌気条件下で接合伝達可能なプラスミドの探索
モデルプラスミドpBP136::gfpが宿主にカナマイシンやクロラムフェニコールを与えることを利用して,当該プラスミドが絶対嫌気性細菌(Desulfovibrio属,Geobacer属,Clostridium属細菌等を想定)に伝達可能かどうかを検証する.また,本研究で新たに得られたPromA群プラスミドに,gfp遺伝子や抗生物質耐性遺伝子を導入し,微好気・嫌気条件下でのプラスミドの伝播の可否について,通性嫌気性細菌や,上記絶対嫌気性細菌を受容菌とした接合実験を行って調べる.
2.嫌気条件下におけるプラスミドの接合伝達現象の検出・分離法の確立
嫌気条件下でプラスミドを受け取った微生物を,GFPの蛍光を指標に検出する方法については確立できたため,平成29年度は,これらの細胞をフローサイトメトリーにて分離し,どのような微生物がプラスミド(pBP136およびPromAプラスミド)を受け取ったか調べ,その宿主域を明らかにする.同時に,好気条件下における宿主域についても調べ,嫌気条件下の結果を比較し,プラスミドが実際の環境中ではどのような微生物に伝達しうるのか,その「真の」宿主域の解明を目指す.また, plasmid-FISHについては,モデルプラスミドのpBP136のコピー数が10以下と低いことを考慮し,まずは当該プラスミドの一部をクローニングした高コピープラスミドを準備し,大腸菌内でのプラスミドDNAの検出を試みているところである.本手法が確立し次第,同様にフローサイトメトリーに適用可能かどうか検証する.

  • Research Products

    (14 results)

All 2017 2016 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (8 results) (of which Invited: 3 results) Remarks (3 results)

  • [Int'l Joint Research] ウイーン大学(オーストリア)

    • Country Name
      AUSTRIA
    • Counterpart Institution
      ウイーン大学
  • [Int'l Joint Research] Julius-Kuen Institut(ドイツ)

    • Country Name
      GERMANY
    • Counterpart Institution
      Julius-Kuen Institut
  • [Journal Article] The behavior of mobile genetic elements (MGEs) in different environments2017

    • Author(s)
      Masaki Shintani
    • Journal Title

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      Volume: 81 Pages: 854-862

    • DOI

      10.1080/09168451.2016.1270743

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] プラスミドを持つ宿主のfitness(適応度)を増加させる原因因子の同定2017

    • Author(s)
      レー・ティー・タン・トゥー,片岡大亮,道羅英夫,金原和秀,新谷政己
    • Organizer
      日本農芸化学会2017年度大会
    • Place of Presentation
      京都女子大学(京都府,京都市)
    • Year and Date
      2017-03-17 – 2017-03-20
  • [Presentation] Transferability of plasmids in various environmental conditions2017

    • Author(s)
      新谷政己
    • Organizer
      Thailand-Japan Collaboration Symposium On Environmental Microbiology and Applications
    • Place of Presentation
      Chulalongkorn University(タイ王国・バンコク)
    • Year and Date
      2017-03-08 – 2017-03-08
    • Invited
  • [Presentation] Behaviors of plasmids and their hosts in different environments2016

    • Author(s)
      新谷政己
    • Organizer
      Wissenshaftliches Kolloquium, Julius Kuehn-Institut
    • Place of Presentation
      Julius Kuehn-Institut(ドイツ・ブラウンシュバイク)
    • Year and Date
      2016-11-08 – 2016-11-08
    • Invited
  • [Presentation] 異なる環境試料からの新規自己伝達性プラスミドの取得2016

    • Author(s)
      仲田裕貴,金原和秀,新谷政己
    • Organizer
      第68回日本生物工学会
    • Place of Presentation
      富山国際会議場(富山県,富山市)
    • Year and Date
      2016-09-28 – 2016-09-30
  • [Presentation] 微好気・嫌気環境下におけるプラスミドの宿主域の解析2016

    • Author(s)
      柳谷洸輔,片岡大亮,金原和秀,大熊盛也,新谷政己
    • Organizer
      日本農芸化学会第177回中部支部例会
    • Place of Presentation
      名古屋大学(愛知県,名古屋市)
    • Year and Date
      2016-09-24 – 2016-09-24
  • [Presentation] Pseudomonas putida PpY101 has factor(s) reliving ‘burden’ on the host cells by carriage of a plasmid.2016

    • Author(s)
      片岡大亮,道羅英夫,金原和秀,新谷政己
    • Organizer
      Plasmid Biology 2016
    • Place of Presentation
      ケンブリッジ大学(英国・ケンブリッジ)
    • Year and Date
      2016-09-18 – 2016-09-23
  • [Presentation] 環境細菌間における可動性遺伝因子の挙動に関する研究2016

    • Author(s)
      新谷政己
    • Organizer
      日本農芸化学会第176回中部支部例会
    • Place of Presentation
      岐阜大学(岐阜県,岐阜市)
    • Year and Date
      2016-07-09 – 2016-07-09
    • Invited
  • [Presentation] プラスミドが宿主に及ぼす「負荷」を軽減する原因因子の同定2016

    • Author(s)
      片岡大亮,レー・ティー・タン・トゥー,道羅英夫,金原和秀,新谷政己
    • Organizer
      環境バイオテクノロジー学会2016年度大会
    • Place of Presentation
      広島県民文化センター(広島県,広島市)
    • Year and Date
      2016-06-13 – 2016-06-14
  • [Remarks] 金原・新谷研究室

    • URL

      http://kimbara-shintani.eng.shizuoka.ac.jp/~tmshint/

  • [Remarks] researchmap

    • URL

      http://researchmap.jp/shintani-masaki/?lang=english

  • [Remarks] researchgate

    • URL

      https://www.researchgate.net/profile/Masaki_Shintani

URL: 

Published: 2018-01-16  

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