2016 Fiscal Year Annual Research Report
メタゲノム法を用いた環境機能分子およびその生合成遺伝子の探索と解析
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15H05629
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤田 雅紀 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (30505251)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | メタゲノム / 海洋天然物 / 殺藻物質 / クオラムセンシング / 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シデロフォア 赤潮藻類殺藻細菌のゲノム解析を行ったところ、未知のシデロフォア生合成遺伝子クラスターが複数存在した。また、極度に鉄欠乏状態と考えられる赤潮発生海域で増殖可能な細菌が生産するシデロフォアについての情報は無いことからその解析を行った。鉄除去培地を用いて培養する事でシデロフォアの生産が確認された。また、精製を試みたところ、シデロフォアとしては珍しく非常に脂溶性の高いものであった。各種クロマトグラフィーにより精製を進め、単一ピークとして得て、構造解析を行っている。
赤潮殺藻物質 Alteromonas属殺藻細菌より殺藻活性物質としてAPO類を見出したが、微生物培養用の培地で単独培養するという海洋環境とはかけ離れた状態での生産であった。そこで、実際にAPO類が海洋環境中で生産され殺藻に関与するかを検討した。炭素源を含まない藻類培養用の培地中において、藻類と殺藻細菌を共培養したところAPOの生産を確認した。その濃度はIC50値よりはるかに低く、藻類細胞表面に近接した殺藻細菌がAPOを生産し局所的にAPO濃度が高まり殺藻現象が起こることが示唆された。そこで、分離膜を用いて近接できない状況で培養したところ、やはり殺藻現象が起きなかったことからも、上記の説が支持された。
クオラムセンシング物質 メタゲノム由来オートインデューサー活性物質を構造解析が可能な量取得するための方法を確立し、10㎎程度の活性物質を精製した。各種スペクトルデータの解析からその構造を新規のインドール誘導体であると決定した。また、オートインデューサー活性を測定したところ、本来のリガンドであるAHLよりも低濃度で活性を示し、また最大活性も高いものであった。さらに、生分解性を調べたところ、活性汚泥と混合しても分解が認められず非常に安定であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シデロフォア Alteromonas属殺藻細菌のゲノム配列を決定し、生合成遺伝子探索ツールにより解析したところ、2つの未知のシデロフォア生合成遺伝子クラスターを見出した。殺藻細菌を鉄除去培地で培養する事でシデロフォアの生産が確認された。また、精製を試みたところ、高い脂溶性という特異な物性を示した。現在までに精製法をほぼ確立し、質量分析およびNMR等のスペクトル解析による構造解析を行っている。
赤潮殺藻物質 殺藻物質としてAPO類を見出したが、高栄養培地中で単独培養するという海洋環境とはかけ離れた状態であった。そこで、炭素源を含まない藻類培養用の培地中藻類と共培養し、生産物を分析した。その結果APOを検出したが、その濃度はIC50値よりはるかに低く、藻類細胞表面で局所的にAPO濃度が高まり殺藻現象が起こることが示唆された。そこで、分離膜を用いて殺藻細菌と藻類が近接できない状況で培養したところ、殺藻現象が起きなかったことからも、上記の説が支持された。
クオラムセンシング物質 メタゲノム由来AI様活性物質の化学的調製法を検討したところ、関連が推測されたインジゴからの誘導法を見出した。本方法を用いて10㎎程度の活性物質を調製し、各種スペクトルデータからその構造を新規のインドール二量体と決定した。また、本来のリガンドであるアシルホモセリンラクトンよりも低濃度で活性を示し、また最大活性も2倍程度高いという興味深いものであった。
海綿由来細胞毒性物質 メタゲノム法を用いてMycale属海綿由来マイカロライド類の生合成遺伝子および生産共生菌の解明を試みた。その結果、全長約120 kbの推定生合成遺伝子クラスターを検出し、またその生産菌としてVerrucomicrobium門に近縁の未解析な細菌を候補として見出した。
上記の通り研究は概ね計画通り進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
シデロフォア 赤潮藻類殺藻細菌が特異なシデロフォアを生産している事が示唆されたため、本年度はその構造決定と生合成遺伝子の解析を行う。また、極度に鉄欠乏状態と考えられる赤潮発生海域で増殖可能な細菌由来シデロフォアの機能解析および殺藻活性との関連について検討する。また、メタゲノム中から見出された未知のシデロフォア生合成遺伝子の解析とその情報に基づいた微生物培養法の確立を検討する。
赤潮殺藻物質 APOの殺藻様式に関する検討を行ったところ、藻類との接触が引き金となりAPOの生産が開始されること、また藻類の細胞表面で局所的に高濃度となり殺藻現象が起こる可能性を示した。一方、APO以外の殺藻物質の生産も否定できないことから、共培養条件下での培養液のメタボローム解析を行う。また、実際の赤潮発生域の海洋環境においてAPOによる殺藻が実際に起こっているのか、LC-MSによる成分分析を行う。
クオラムセンシング物質 メタゲノム由来オートインデューサー活性物質の構造を確定し、新規のインドール誘導体であることを明らかにした。本年度は明らかにした物質が実際に本来のオートインデューサーであるAHL受容体を介してクオラムセンシング現象を起こすのかどうか、およびレポーターアッセイ系ではなく野生株の細菌においても活性を示すのかなど、本物質が実際に自然界でオートインデューサーとして機能しうるのかについて検討を進める。
海綿由来細胞毒性物質 マイカロライド類の推定生合成遺伝子および生産共生細菌メタゲノム情報から見出した。本年度はメタゲノムデータから生産菌の生理生態に関する情報を抽出し、分離培養を試みる。また、環境中での生産菌の動態の解析を行うことで、海綿がどのように生産菌を獲得し、またマイカロライド類が環境中でどのように機能しているのかについて各成長段階での成分分析を行い解析する。
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Research Products
(5 results)
