2017 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of functional compounds and biosynthetic genes by metagenomic methods
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15H05629
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
藤田 雅紀 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (30505251)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 海洋天然物 / メタゲノム / 生合成 / 殺藻細菌 / シデロフォア / クオラムセンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シデロフォア：昨年度の研究において、殺藻細菌が特異なシデロフォアを生産する事が示唆されていたが、本年度はその単離および構造決定を行い、両親媒性の特徴的な新規シデロフォアであることを明らかにした。また、興味深いことに赤潮原因藻類であるChattonella antiquaに対して顕著な殺藻活性を示したことから、赤潮発生域において過剰に増殖した微細藻類を殺滅し、有機成分のみならず鉄も同時に奪取するという化学生態的な機能が示唆された。
殺藻物質：函館市五稜郭外堀から分離された殺藻活性を示す細菌および活性物質の同定を試みた。30株分離した細菌の種を16SrRNA配列を指標に系統分析したところ、Pseudoalteromonas属およびDelfitia属が検出された。また、いずれも殺藻物質を環境中に分泌する間接殺藻型であることを明らかにした。Delfitia属の一つについて、培養液から殺藻物質の精製を進めたところ、比較的低極性画分に活性が認められ、現在精製を進めている。
クオラムセンシング物質：メタゲノム由来オートインデューサー（AI）活性物質を同定し、本来のAIであるAHLよりも高い活性を示したが、構造的に全く異なる化合物がどの様にAI様活性を示すのかは不明である。AHLと同様に受容体を介する経路と、直接DNAに結合しプロモーター様の活性を示す二つの説を考え、検討を行った。その結果、メタゲノム由来AI活性物質は直接DNAに結合する事が示唆された。
海綿由来生理活性物質：ミカーレ属海綿由来抗腫瘍物質の生産菌の分布をその生合成遺伝子を指標に検討した。その結果、ミカーレ属海綿が生息する海域の海水・砂泥・他の海綿由来のメタゲノムDNAからは一切生産菌が検出されなかった。これらの結果は、生産菌が垂直伝播により次世代へ継承されることを示すものであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シデロフォア：赤潮藻類殺藻細菌からシデロフォアとしては珍しい両親媒性の新規化合物を同定した。また、ゲノム解析からその生合成遺伝子を特定している。さらに赤潮原因藻類であるC. antiquaに対し顕著な殺藻活性を示した事から、赤潮発生域において微細藻類を殺滅し、その有機成分のみならず鉄を同時に奪取する機能を有する可能性が示唆された。化合物および生合成遺伝子を特定しているので、今後は環境中における機能解析を行う。
赤潮殺藻物質：湖沼において水草表面に高密度に存在する殺藻活性を有する細菌を多数分離しており、多くはDelfitiaあるいはPseudomonas属である事、さらに活性物質分泌型である事を確認している。活性化合物の同定と生産機構の解明も進行中であり、これまでの検討から逆相樹脂に吸着し、実験室環境で安定な非常に取り扱いやすい化合物である事を確認しており、今後ゲノム情報と合わせて速やかな単離と構造決定が可能と考えられる。
クオラムセンシング物質：メタゲノム由来AI様物質の活性機構解明を目的に、光学分割により立体異性体で活性が異なるか検討が、速やかに異性化する事が明らかになり、立体異性体間の活性比較はできなかった。一方、DNA結合試験を行ったところ、高いDNA結合を持つことが明らかになった。また、メチル誘導体も同等の活性を有するなど、構造活性相関情報を得る事が出来、今後の活性機構解明につながる情報を得ている。
海綿共生細菌由来生理活性物質:ミカーレ属海綿由来マイカロライド生産菌を特定したため、次いで環境中における分布を調査した。その結果、ミカーレ属海綿中にのみ生息し、周辺海水や砂泥あるいは近傍の他種海綿からは一切検出できなかった。その共生は垂直伝播により次世代へ継承されると考えられ、分離培養技術開発のための基礎情報を得ている。上記の通り研究は概ね計画通り進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
シデロフォア：両親媒性で殺藻活性を有する新規シデロフォアを得た。ただし、細菌培養用の高栄養培地での生産であるため、実際に赤潮が発生している海洋環境で生産されるかは不明である。そこで、赤潮発生海水を模した培地での生産の有無や、藻類の存在により生産が誘導されるか等を検討する事で、実際の環境中で機能しうるかどうか明らかにする。また、殺藻活性機構と両親媒性の物性が関与するのかなど、関連シデロフォア類を用いて確認すると同時に、その殺藻機構を明らかにする。
赤潮殺藻物質：Delftia属細菌が比較的低極性の殺藻物質を生産する事が明らかになったので、その活性本体の同定を進めると同時に、ゲノム解析を行いその生合成遺伝子も明らかにする。その後、アオコ発生域においても実際に本物質が存在し、機能するかどうかについて、資料水の採取と物質および生合成遺伝子発現の分析を行う。Alteromonas属赤潮殺藻細菌が生産する未同定活性物質についても、LCMSを用いた主成分分析による解析を行う。
クオラムセンシング物質：アシルホモセリンラクトン(AHL)受容体であるLuxRの発現系構築と結合試験を行う事で、オートインデューサー様活性を示す機構を明らかにする。また、レポーターアッセイ系ではなく野生株の細菌においても活性を示すのか、またどの範囲の細菌種にまで機能するのかなど、その汎用性を検討する。
海綿由来細胞毒性物質：生産菌がミカーレ属海綿中に特異的に存在する事が明らかになったが、その共生様式が細胞内なのか細胞外なのか、特異的な共生器官が存在するのかどうかなど不明な点も多い。そこで本年度は、単年生のミカーレ属海綿の生活環の各段階において、どの様な共生様式をとっているのか、局在性の観点から明らかにする事で、培養可能化のための情報を得る。
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