2015 Fiscal Year Annual Research Report
伴侶動物の尿中エクソソーム由来マイクロＲＮＡの解析：革新的腎障害マーカーへの応用
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15H05634
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
市居 修 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 准教授 (60547769)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 慢性腎臓病（CKD） / マイクロRNA（miRNA） / バイオマーカー / 尿中エクソソーム / イヌ・ネコ / 伴侶動物 / 獣医学 / 伴侶動物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、伴侶動物の慢性腎臓病（CKD）が急増している。腎臓の細胞が放出し、かつ尿中で検出できるバイオマーカーは、腎局所病変の存在ならびに腎病理型の非侵襲的予測に有用である。我々は、次世代バイオマーカーとしてマイクロRNA（miRNA）に着目し、尿中エクソソームに包含されるmiRNAを伴侶動物の“CKD診断バイオマーカー”に応用することを目的としている。本年度は下記の計画を実施した。
計画①：北海道大学動物医療センターならびに協力民間動物病院からイヌとネコの尿サンプルを収集し、血中BUNおよびクレアチニン値のデータをもとに健常群と腎臓病群（各群n>23）に分けた。収集した尿からエクソソームを抽出し、RNAを精製後、各種解析に用いた。尿中エクソソームサンプルを用いて、エクソソームマーカー（CD9、Tsg101）をウエスタンブロッティング法で検出し、伴侶動物の尿にもエクソソームが存在することを確認した。上記4群（各群1プールサンプル）のRNAサンプルを用いて、次世代シークエンス解析を行った。さらに、得られた解析データならびに過去のイヌ・ネコの腎臓内miRNA発現データを基に尿中エクソソーム由来miRNA発現パラメーターを作出した。結果、イヌ・ネコ共に腎臓病群の尿中エクソソーム由来miR-486/let-7b比が健常群のそれよりも高い傾向にあった。イヌ・ネコにおいて、let-7bの腎臓内発現量が高く、let-7bは尿中エクソソーム由来miRNAの発現補正に有用であると考えられた。腎臓内におけるmiR-486の機能は未だ不明である。
計画②：並行して、次世代シークエンス解析によって選抜したバイオマーカーmiRNA候補が関与する病理イベントをモデル動物でも解析している。MRL/MpJやB6.MRLc1マウスをモデル動物として用いているが、本年度はコットンラットが尿細管間質病変を主体とするネコ様CKDを発症することを発見し、尿中エクソソーム由来miRNAと腎病理イベントの解析に有用なモデルになると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はイヌおよびネコの尿からエクソソーム由来miRNAを精製し、次世代シークエンス解析を実施し、バイオマーカー候補の選定を行った。当初の計画通り進行しており、今後も選定作業をすすめていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下の研究計画を遂行する。
計画①：CKDのイヌ、ネコ、モデル動物の尿・腎臓中の候補miRNA発現動態と腎病理の相関を解明する。
健常群とCKD群の尿由来エクソソーム・腎臓内の候補miRNAをTaqMan PCR解析で定量・比較する。尿および腎臓内の候補miRNAの変動を各CKDステージで明らかにし、腎病理(病理組織スコア、病態関連分子のmRNA・蛋白発現量)・腎機能(血中BUN・Cr、尿蛋白値)との相関を解析する。in situ hybridization法とLaser Microdissection法で候補miRNAの腎臓内局所発現を明らかにする。以上より、選抜した候補miRNAが関与するCKDの病理イベントを決定し、バイオマーカーとしての特性・有用性を明らかにする。本解析にはパラフィン切片を利用でき、長期保存サンプルを導入して症例数を増やす。
計画②：in vitro 培養系を用いて、バイオマーカーmiRNAが制御する細胞内イベントを同定する。
動物で同定したmiRNA発現細胞と近縁の細胞株を用い、バイオマーカーmiRNAまたはそのsiRNAを細胞に導入する。導入後、形態変化を観察すると共に、網羅的mRNA発現解析で影響を受ける遺伝子群を同定し、miRNAの下流シグナルを解析していく。本解析により、バイオマーカーmiRNAの標的mRNAとその下流経路を同定し、臨床応用への基盤となるmiRNAのバイオインフォメーションを明らかにする。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Female cotton rats (Sigmodon hispidus) develop chronic anemia with renal inflammation and cystic changes2016
Author(s)
Ichii O, Nakamura T, Irie T, Kouguchi H, Nakamura D, Nakamura S, Sato S, Yokoyma K, Horino T, Sunden Y, Elewa YH, Kon Y
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Journal Title
Histochemistry and Cell Biology
Volume: in press
Pages: in press
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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