2015 Fiscal Year Annual Research Report
シアリダーゼの局所イメージング新技術を利用したインフルエンザNA研究の新展開
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15H05644
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
高橋 忠伸 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (20405145)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / シアリダーゼ / ノイラミニダーゼ / 蛍光イメージング / 薬剤耐性 / バキュロウイルス / 感染 / BTP3-Neu5Ac |
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| Outline of Annual Research Achievements |
水に不溶性の蛍光物質であるベンゾチアゾリルフェノール誘導体（BTP3）にシアル酸（Neu5Ac）を付加したシアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」を開発した。シアリダーゼを発現するインフルエンザA型及びB型ウイルス感染細胞を蛍光イメージングすることができ、蛍光化された細胞からはウイルス株の単離もできる。本研究はシアリダーゼ蛍光イメージング剤を利用して、ウイルスシアリダーゼの機能解析と抗インフルエンザ薬（シアリダーゼ阻害剤）の耐性化検出法の開発を行う。
BTP3-Neu5Acがシアリダーゼを持つパラインフルエンザウイルスである、ヒトパラインフルエンザウイルスやおたふく風邪ウイルス、さらにこれらの感染細胞に発現するシアリダーゼ活性を蛍光イメージングすることに成功した。バキュロウイルス-タンパク質発現システムによりインフルエンザA型ウイルスの膜糖タンパク質であるノイラミニダーゼ（NA、シアリダーゼ）を分泌型タンパク質に改変し、精製した。細胞内への取り込まれる様子をBTP3-Neu5Acによりイメージングすることを試みるため、このシアリダーゼにエンドサイトーシスシグナルを挿入した分泌型NAを作製した。また、抗インフルエンザ薬（シアリダーゼ阻害剤）に耐性化したインフルエンザA型ウイルスやその感染細胞あるいは薬剤耐性化変異を導入したシアリダーゼ発現細胞を選択的に蛍光イメージングする方法を確立した。薬剤耐性ウイルスの感染細胞集団を選択的に蛍光イメージングし、薬剤耐性株を高効率に単離することにも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
シアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」が、シアリダーゼを持つヒト病原ウイルスであるヒトパラインフルエンザウイルスやおたふく風邪ウイルスとそれらの感染細胞の蛍光イメージングに利用できることを報告した。これらのウイルスの蛍光化された感染細胞集団から、ウイルス株の単離も可能である。
バキュロウイルス-タンパク質発現システムにより酵素活性を有するNAを生産することに成功した。また、インフルエンザA型ウイルスのNAは膜糖タンパク質であるため、溶液中では可溶化せずに凝集する。タンパク質を回収するとき細胞を破砕する必要があるため、細胞内在性のタンパク質の混在や精製操作の煩雑さなどの問題がある。そこで、シアリダーゼの膜貫通領域を除去し、分泌型タンパク質に改変した分泌型NAの生産及び精製に成功した。また、エンドサイトーシスシグナルを挿入した分泌型NAも作製した。これらのNAのシアリダーゼ活性を確認した。
BTP3-Neu5Acと抗インフルエンザ薬（NA阻害剤）を併用することで、簡便、迅速に薬剤耐性インフルエンザウイルスやその感染細胞を選択的に蛍光イメージングすることに成功した。薬剤耐性ウイルスと感受性ウイルスの混合液の感染細胞から、薬剤耐性ウイルス感染細胞を蛍光イメージングすることで、薬剤耐性ウイルス株の極めて高効率な単離に成功したことは予想以上の結果であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
シアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」の応用法を確立していく。特に本研究では、インフルンザウイルス感染におけるシアリダーゼ活性の意義解明とインフルンザウイルスのNA阻害剤に対する薬剤耐性化機構の解析を、シアリダーゼ蛍光イメージング剤を活用して進める。
バキュロウイルス-タンパク質発現システムにより分泌型NAを生産できたことから、エンドサイトーシスシグナル挿入シアリダーゼによりウイルスの細胞侵入過程（エンドサイトーシス過程）を疑似的に再現させ、エンドサイトーシス過程におけるシアリダーゼ活性の機能について解析する。エンドサイトーシス下のNAのシアリダーゼ活性を継時的に蛍光イメージングし、pHの低下に依存してどこまで活性が維持されるのかを検討する。また、ネイティブのNAがホモ四量体であることから、四量体化シグナルを挿入した分泌型NAタンパク質四量体の作製を試みる。ウイルス表面上のネイティブに近いNAの機能解析が実施できるものと予想される。
薬剤耐性インフルエンザウイルスの高効率単離法を確立したので、シアリダーゼ阻害剤存在下で増殖性を獲得したウイルスを本法により選択的に単離していき、そのシアリダーゼ遺伝子配列を解析する。薬剤耐性化変異を効率的に解析することができる。未報告の変異についてはシアリダーゼ遺伝子に導入して哺乳動物細胞へ発現させる。各抗インフルエンザ薬に対する感受性を比較する。
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| Remarks |
研究代表者の受賞 2件：日本ウイルス学会 平成27年度 杉浦奨励賞、静岡県立大学（第二回）学長表彰
研究協力者の受賞 8件
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Research Products
(59 results)
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[Journal Article] Easy and Rapid Detection of Mumps Virus by Live Fluorescent Visualization of Virus-Infected Cells2015
Author(s)
Tadanobu Takahashi, Takashi Agarikuchi, Yuuki Kurebayashi, Nona Shibahara, Chihiro Suzuki, Akiko Kishikawa, Keijo Fukushima, Maiko Takano, Fumie Suzuki, Hirohisa Wada, Tadamune Otsubo, Kiyoshi Ikeda, Akira Minami, Takashi Suzuki
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Journal Title
PLoS One
Volume: 10
Pages: e0144038
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Rapid fluorescent detection assay for human parainfluenza viruses2015
Author(s)
Tadanobu Takahashi*, Maiko Takano* (*they contributed equally as first authors), Yuuki Kurebayashi, Takashi Agarikuchi, Chihiro Suzuki, Keijo Fukushima, Shunsaku Takahashi, Tadamune Otsubo, Kiyoshi Ikeda, Akira Minami, Takashi Suzuki
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Journal Title
Biol. Pharm. Bull.
Volume: 38
Pages: 1214-1219
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Amino acid substitutions contributing to α2,6-sialic acid linkage binding specificity of human parainfluenza virus type 3 hemagglutinin-neuraminidase2015
Author(s)
Keijo Fukushima*, Tadanobu Takahashi* (*they contributed equally as first authors), Hiroo Ueyama, Masahiro Takaguchi, Seigo Ito, Kenta Oishi, Akira Minami, Erika Ishitsubo, Hiroaki Tokiwa, Toru Takimoto, Takashi Suzuki
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Journal Title
FEBS Lett.
Volume: 589
Pages: 1278-1282
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Recombinant IgA specific for influenza A virus hemagglutinin: production, functional analysis and formation of secretory IgA2015
Author(s)
Kentaro Shoji, Tadanobu Takahashi, Kohta Kurohane, Koki Iwata, Takeshi Matsuoka, Shogo Tsuruta, Takatomo Sugino, Masaki Miyake, Takashi Suzuki, Yasuyuki Imai
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Journal Title
Viral Immunol.
Volume: 28
Pages: 170-178
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Consecutive oral administration of Bifidobacterium longum MM-2 improves the defense system against influenza virus infection by enhancing natural killer cell activity in a murine model2015
Author(s)
Tomohiro Kawahara, Tadanobu Takahashi, Kenta Oishi, Hiromu Tanaka, Midori Masuda, Shunsaku Takahashi, Maiko Takano, Tatsuya Kawakami, Keijo Fukushima, Hiroaki Kanazawa, Takashi Suzuki
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Journal Title
Microbiol. Immunol.
Volume: 59
Pages: 1-12
DOI
Peer Reviewed
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