2016 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanism for toxic effect of methylmercury
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15H05714
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
永沼 章 東北大学, 薬学研究科, 名誉教授 (80155952)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黄 基旭 東北大学, 薬学研究科, 准教授 (00344680)
外山 喬士 東北大学, 薬学研究科, 助教 (50720918)
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| Project Period (FY) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| Keywords | メチル水銀 / トキシコロジー / 転写調節 / シグナル伝達 / オートクライン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は網羅的スクリーニングによってメチル水銀毒性増強作用を有する細胞内因子として転写因子様蛋白質tmRT1を同定し、メチル水銀によってtmRT1を介して合成誘導され細胞外に放出されるTNFαなどの細胞障害性因子が細胞毒性を発揮していることを明らかにした。本研究はこの現象の機構解明を目的としている。本年度はまず、tmRT1高発現が細胞の増殖能を約20%低下させることから、本現象に関わるtmRT１中の部位を調べた。その結果、細胞増殖抑制作用にはtmRT1の153～161アミノ酸（TRAF6結合ドメイン）と216～222アミノ酸（核移行シグナル）が重要であり、そのうちTRAF6結合ドメインがtmRT1のTNF-α遺伝子プロモーター領域への結合にも必要であることが判明した。また、tmRT1がTRAF6ドメインを介して、TNF-α遺伝子の転写開始点から上流-1161～-1125の領域に結合することによってTNF-α発現誘導に関与していることが示唆された。メチル水銀はtmRT1中のシステイン残基に結合することによってtmRT1の転写活性を上昇させる可能性が考えられる。tmRT1中に存在する7つのシステイン残基を一つずつセリンに置換した変異体をtmRT1欠損細胞に導入して検討したところ、メチル水銀がCys100との結合を介してtmRT1の転写活性を上昇させていることが示唆された。一方、tmRT1と結合する蛋白質をプルダウン法で検索したところHSPA1B（ヒートショック蛋白質70の一種）およびXRCC6（DNA修復関連蛋白質）が同定され、両者の発現をそれぞれ抑制することによってメチル水銀によるTNF-αの発現誘導の程度がさらに増加した。このことから、両因子はtmRT1の抑制因子として機能している可能性が考えられる。なお、tmRT1ヘテロノックアウトマウスの作製に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、tmRT1高発現細胞が示す増殖低下現象およびtmRT1のTNF-α遺伝子プロモーター領域への結合にtmRT1中のTRAF6結合ドメインが必要なことが判明し、さらに、tmRT1がTRAF6ドメインを介して結合するTNF-α遺伝子プロモーター領域を40bpまで絞り込むことにも成功した。また、メチル水銀がtmRT1中のCys100との結合を介してtmRT1の転写活性を上昇させていることが示唆された。このように、tmRT1による転写調節機構とメチル水銀によるtmRT1活性化機構の一部を明らかにすることができ、今後の研究進展のための突破口が開かれた。tmRT1と結合してtmRT1の活性を抑制する蛋白質を2つ同定したことも、今後の研究を推進する上で大きな収穫である。tmRT1ヘテロノックアウトマウスの作製にも成功したことから、次年度以降の研究の成果が大いに期待される。したがって、本研究は計画に従って「概ね順調に進展している」と判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究内容をさらに発展させて、以下のように、機構解明研究を進める。
１．メチル水銀によるtmRT1の活性化機構：（１）メチル水銀によるtmRT1の細胞内レベル増加とTNF-α誘導との関係を明らかにし、さらに（２）tmRT1へのメチル水銀の直接的な結合とその様式、および、その結合がtmRT1活性に与える影響を解明する。また、（３）平成28年度にtmRT1と結合する蛋白質を同定したので、その作用機構を明らかにする。
２．メチル水銀によるtmRT1を介したTNF-α発現誘導機構の解明：培養細胞を用いて次の検討を行う。（１）TNF-α発現レベルのtmRT1による調節とその意義、（２）メチル水銀によるtmRT1を介したTNF-α発現誘導に関わるプロモーター領域の更なる絞り込みと特定、（３）メチル水銀によるプロモーター領域へのtmRT1の結合促進作用機構、（４）メチル水銀によるtmRT1を介したTNF-α発現誘導に関わる補因子の同定と作用機構解明。
３．TNF-αによるメチル水銀毒性増強機構の解明：細胞外に放出されたTNF-αはTNF受容体と結合することによってシグナル伝達を介して細胞増殖を抑制すると思われる。すでに本研究によってTNF-αによるメチル水銀毒性増強に関与するTNF受容体分子種（TNFR3）が判明している。そこで（１）メチル水銀によるTNF-α/ TNFR3を介した細胞増殖抑制に関与するシグナル伝達系を明らかにすると共にその機構を検討する。また（２）メチル水銀によって細胞外放出が促進されるTNF-α以外の細胞障害性因子を検索・同定する。
４． tmRT1ノックアウトマウスを用いた検討：tmRT1ノックアウトマウスの作製が終了したので、メチル水銀毒性とtmRT1との関係を検討する。
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