2017 Fiscal Year Annual Research Report
Regulatory mechanism of immunoglobulin diversification and genome instability through RNA-editing by AID
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15H05784
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
本庶 佑 京都大学, 高等研究院, 特別教授 (80090504)
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| Project Period (FY) |
2015-05-29 – 2019-03-31
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| Keywords | DNA切断 / 組換え / 獲得免疫 / 免疫記憶 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Top1との免疫共沈法によりTop1に結合する多くの制御タンパク質を同定し、分類した結果、ヒストン修飾、mRNAプロセシング、転写に関与するものの他にクロマチンリモデリング因子が同定された。特に、以前に免疫グロブリン遺伝子のDNA切断に必要と同定されたFACT複合体、ATP依存性クロマチン変換酵素SMARCA4および転写活性化マーカーであるトリメチルH3K4はすべて、機能的に重要なTop1との相互作用分子だった。すなわち、SMARCA4はTop1の免疫グロブリン遺伝子座へのリクルートを促進し、一方、FACT複合体はTop1をH3K4me3のヒストン修飾に引き寄せるアダプターとして働き、Top1によるDNA切断を可能にすることを発見した。この成果をさらに深め、AIDによるDNA切断とクラススイッチ組換え(CSR)に特異的なクロマチン環境を明らかにするため、S領域中にLexA結合配列を導入したCH12細胞株からLexAタンパク質を用いた免疫沈降によりAID依存的にS領域に集積するタンパク質を複数同定した。我々は今までにDNA切断端処理過程を、DNA切断端に共有結合したTop1の除去に関わる反応、切断端を二重鎖盲端又は短い切断端に切り揃える反応、二重鎖を２つのS領域の間でたぐり寄せる反応に別れることを明らかにしたが、得られた因子群の各ステップへの関与を解析中である。また、AIDの単量体は主にhnRNP Kと共局在し、二量体はhnRNP Lと共局在することをグリセロール密度勾配法により証明した。AIDのC末端変異体が二量体形成能を欠くことに加え、AIDのN末端変異体のうち、体細胞変異が損なわれるがCSR能が保たれたタイプの変異体は二量体／多量体分画に分布することから、AIDの二量体／多量体形成による構造変換がCSRの組換え段階に関連することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) AIDノックアウトと野生型のCH12細胞で発現しているRNAを次世代シーケンシングを用いて網羅的に解析することによりAIDにより編集されたRNAを同定した。興味深いことに、ある遺伝子のエクソン部分に起きていたものは10以上あるアイソフォームに共通に含まれるエクソンであるにもかかわらず、特定のスプライシング産物に限定したRNA編集であり、RNA編集に働く分子メカニズムについて新たな発見があった。
2) AIDの共役因子hnRNP KはRNA結合タンパク質であるが、数あるRNA結合モチーフのうち、３つのKHドメインに１つずつ含まれるGXXGモチーフ、リンカードメインに含まれる５つのRGGモチーフのいずれもがCSRとSHMに必須であることを明らかにした。さらにこれらのモチーフ変異体はAIDとの相互作用を必ずしも失っておらず、AIDとhnRNP Kとの複合体安定性に働くRNAとAIDにより編集されるRNAとは異なる可能性が示された。これらの成果により、次の段階として、さらにAIDにより編集されたRNAのうち、DNA切断に関わるものを特定することが可能になった。
3) 新しくクラススイッチ(CSR)に重要なタンパク質を同定した。Phf5aはATP依存性のヘリカーゼとスプライソソームを結ぶスカフォールドタンパク質であり、多能性幹細胞の全能性制御や分化過程、腫瘍細胞の増殖制御機構で転写やスプライシングに関わることが示唆されながらも、詳細な分子機構が不明であった。Phf5aはAID活性化による免疫グロブリン(Ig)遺伝子組換えのうち、体細胞変異には影響がないものの、CSRと染色体転座に大きく関わることを初めて明らかにした。同分子はS領域においてp400依存的にヒストンバリアントH2A.Zを維持していおり、これがCSRと転座においてDNA損傷シグナリングと修復に重要であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) AIDによるRNAの網羅的C to U編集解析については複数得られた分子について編集頻度を確定し、ノックダウンやノックアウト法、さらに人工的に合成した編集後RNA分子のCH12細胞へ過剰発現法にて、免疫グロブリン遺伝子組換えにおける機能を検証する。
2) DNA切断に特異的なRNA編集を同定するため、hnRNP Kについて今までに得られた変異体のうち、構造的変化が比較的少ないGXXG変異体と野生型hnRNP Kとで免疫沈降実験を行い、集積するRNA分子を比較しAIDにより編集されるRNA分子を同定する。それにより得られた結果と、1)に示した網羅的解析の結果と合わせてDNA切断に関わるAID編集RNAを特定する。
3) hnRNP LについてもhnRNP Kと同様に、免疫沈降法によりAIDによるRNA編集を検出する方法を取った。現在候補となるRNA分子が得られておりそれらのDNA修復過程への関与とその特異性、分子メカニズムを解析する。
4) Top1 mRNAに結合するmiRNAはTop1 mRNA特異的なアンチセンスオリゴとRNA分子間ライゲーションを用いたトラップ法を用いて解析を進めている。AIDの活性化に依存するTop1mRNA結合miRNAを同定し、AIDによるIg遺伝子組換えに直接関わるmiRNAを明らかにする。
5) AIDの結晶構造解析について、AIDに各種結合候補分子などを融合させた分子の結晶化を試みる。昨年度までにスクリーニングした分子で分散性が良好であったものがなく、種々の因子の融合分子を作成している。また、Top1によるDNA切断ターゲット特異性決定機構を明らかにするためLexA結合配列をIg遺伝子に組み込んだ細胞を作成し、Ig遺伝子に特異的に集積する分子候補が得られた。RNA修飾を経由してDNA修復に関わる分子を得たため、その解析を進める。
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