Engulfment of apoptotic cells and asymmetry of plasma membranes

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H05785
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 長田 重一 大阪大学, 免疫学フロンティア研究センター, 寄附研究部門教授 (70114428)
• Project Period (FY): 2015-05-29 – 2020-03-31
• Keywords: アポトーシス / 自然免疫 / リン脂質 / マクロファージ / 貪食

Outline of Annual Research Achievements

アポトーシスを起こした細胞はフォスファチジルセリン(PtdSer) を "eat me" シグナルとして提示し、マクロファージによって貪食される。私達は、死細胞の貪食に関与する分子(Tim4, MER, MFG-E8)を同定するとともに、PtdSerを細胞膜の内膜と外膜の間でスクランブルさせる分子（スクランブラーゼ, Xkr8とTMEM16F）、外膜から内膜へ移動させる分子 (フリッパーゼ, ATP11C)を同定してきた。本研究はこれら分子の作用機序、生理作用を明らかにすることを目的としている。
本年度は、Ca2+ によって活性化されるスクランブラーゼTMEM16F（１０個の膜貫通領域を持つタンパク質）はホモ２量体として存在し、Ca2+ が直接その膜貫通領域（第VI-VIII番目の貫通領域）に存在する５個のグルタミン酸やアスパラギン酸残基に結合、そのコンフォメーションを変化させることを見出した。一方、同じように１０個の膜貫通領域を持つXKR8 スクランブラーゼが細胞膜に局在するためにはIgGファミリーに属するタイプI膜タンパク質Basigin(BSG) あるいはNeuroplastin(NPT) が必要であり、細胞膜上でこれらのどちらかと1:1の複合体を形成していることを見出した。アポトーシスを起こした細胞ではXkr8はそのC-末端部位でカスパーゼによって切断、Xkr8-BSG/NPTはヘテロ４量体となり、スクランブラーゼとして作用する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

スクランブラーゼの活性化機構に関して研究はほぼ順調に推移した。TMEM16FはCa2+に依存して作用するスクランブラーゼではあるがCa2+結合能は弱くCa2+によって直接活性化されるか、Ca2+が結合する他の分子と会合しているか不明であった。私達はこの分子を精製、TMEM16Fはホモ２量体として存在することを見出した。一方、その精製過程でTMEM16FはCa2+が存在しない溶液中ではaggregationすることを見出した。そこで、Ca2+が結合すると考えられるAsp, Glu残基に網羅的に変異を導入、Ca2+存在下でもaggregationする変異を同定、膜貫通領域に存在する5個のアミノ酸残基をCa2+結合部位と同定した。実際、これら残基に変異を持つタンパク質はそのスクランブラーゼ活性を完全に失った。

一方、Xkr8は膜を可溶化するdetergentの種類によってBlue-Native PAGE での挙動が大きく異なることに気がついた。すなわち、digitoninなどのmildなdetergent の存在下では250kDa、Triton X100などの強いdetergent では140 kDaのタンパク質として挙動した。そこで、Flag-tagged Xkr8発現細胞の膜分画をdigitoninで可溶化、Xkr8複合体を抗Flag抗体に吸着、会合しているタンパク質をTriton X100を用いて 解離させ、MS解析を行った。その結果Xkr8はBSGあるいはNPTと２量体を形成していることが判明した。ついでBSG、NPTをノックアウトした細胞を樹立したところ、Xkr8は細胞膜に局在せずERに蓄積した。このことからBSG/NPTはシャペロンとしてXkr8を細胞膜にエスコートすると結論した。

以上の結果はBiochemistry、およびPNAS に２方の論文として発表した。

Strategy for Future Research Activity

スクランブラーゼは非特異的にリン脂質を細胞膜の内層と外層の間で輸送する。私達はこれまでにTMEM16Fによく似たアミノ酸配列を持つTMEM16EはERに局在するためにその活性が不明であるが、膜貫通領域IV-Vに渡る35個のアミノ酸を細胞膜に局在し、Cl-チャネルとして作用するTMEM16Aの対応する部分と置換するとスクランブラーゼの活性を示すことからこの分子はERでのCa2+依存スクランブラーゼと結論した。TMEM16にはそのほかにTMEM16H や16K が存在することからこれらの対応する領域をTMEM16Aに導入、スクランブラーゼ活性を持つかどうか検討する。また、ATP11Cのシャペロンとして作用するCDC50AがATP11Cのフリッパーゼ活性に必要かどうかCDC50Aに種々の変異を導入することにより検討する。一方、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食にはPtdSerに対する受容体として作用するTim4、チロシンキナーゼ受容体であるTAM family タンパク質（Tyro3、AxlおよびMer）が関与しているが貪食におけるこれら分子の関係を生化学的に解析する。また、Tim4、TAM受容体のマクロファージを同定するとともにこれらマクロファージがアポトーシス細胞を貪食するに際し、Tim-4、TAM受容体の要求性を明らかにする。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Wellcome Trust-MRC Inst of Metabolic Sci(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: Wellcome Trust-MRC Inst of Metabolic Sci
• [Int'l Joint Research] National Yang-Ming University(台湾)
  • Country Name: その他の国・地域
  • Counterpart Institution: National Yang-Ming University
• [Int'l Joint Research] Tytgat Inst for Liver and Intestinal Res(オランダ)
  • Country Name: NETHERLANDS
  • Counterpart Institution: Tytgat Inst for Liver and Intestinal Res
• [Int'l Joint Research] New Jersey Medical School/Cincinnati Children's Hospital Res Found(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: New Jersey Medical School/Cincinnati Children's Hospital Res Found
• [Int'l Joint Research] Heidelberg University(ドイツ)
  • Country Name: GERMANY
  • Counterpart Institution: Heidelberg University
• [Int'l Joint Research]
  • # of Other Countries: 1
• [Journal Article] Cardiac myofibroblast engulfment of dead cells facilitates recovery after myocardial infarction. (2017)
  • Author(s): Nakaya, M., Watari, K., Tajima, M., Nakaya, T., Matsuda, S., Ohara, H., Nishihara, H., Yamaguchi, H., Hashimoto, A., Nishida, M., Nagasaka, A., Horii, Y., Ono, H., Iribe, G., Inoue, R., Tsuda, M., Inoue, K., Tanaka, A., Kuroda, M., Nagata, S. and Kurose H.
  • Journal Title: J. Clin Invest. Volume: 127 Pages: 383-401
  • DOI: 10.1172/JCI83822
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of Ca2+ in the Stability and Function of TMEM16F and 16K. (2016)
  • Author(s): Ishihara, K., Suzuki, J. and Nagata, S.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 55 Pages: 3180-3188
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.6b00176
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Xkr8 phospholipid scrambling complex in apoptotic phosphatidylserine exposure. (2016)
  • Author(s): Suzuki, J., Imanishi, E. and Nagata, S.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 113 Pages: 9509-9514
  • DOI: 10.1073/pnas.1610403113
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Osteopontin in Spontaneous Germinal Centers Inhibits Apoptotic Cell Engulfment and Promotes Anti-Nuclear Antibody Production in Lupus-Prone Mice. (2016)
  • Author(s): Sakamoto, K., Fukushima, Y., Itoh, K., Matsuda, M., Nagata, S. Minato, N. and Hattori, M.
  • Journal Title: J. Immunol. Volume: 197 Pages: 2177-2186
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1600987
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Exposure of Phosphatidylserine on the Cell Surface. (2016)
  • Author(s): Nagata, S., Suzuki, J., Segawa, K. and Fujii, T.
  • Journal Title: Cell Death Differ. Volume: 23 Pages: 952-961
  • DOI: 10.1038/cdd.2016.7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell biology: Killer enzymes tethered. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Journal Title: Nature Volume: 533 Pages: 474-476
  • DOI: 10.1038/nature18439
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2017)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: 【Keynote address】EMBO Workshop on "Cell death, inflammation, and cancer", Innsbruck University Conference Center, Obergurgl, AUSTRIA
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Asymmetrical Distribution of Phospholipids at Plasma Membrane, and Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2017)
  • Author(s): 長田 重一
  • Organizer: 【会長特別企画講演】第81回日本循環器学会学術集会 ANAクラウンプラザホテル金沢 金沢
  • Invited
• [Presentation] Exposure phosphatidylserine in apoptotic cell death, and engulfment of dead cells. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: The International Meeting on "Cell Death, Inflammation and Immunity", Creta Maris Beach Resort, Creta, GREECE
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Scramblases and Flippase at Plasma Membrane. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: Meeting-workshop on Chorea-Acanthocytosis & Vesicular-Vacuolar Transport, University of Michigan, Michigan, USA
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Exposure of phosphatidylserine to the cell surface. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: The 3rd Nobel Conference entitled “The Cell Cycle and Cell Death in Disease”, Karolinska Institutet, Stockholm, SWEDEN
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: RIKEN IMS Summer Program (RISP 2016), RIKEN-IMS, Yokohama, JAPAN
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: The RIKEN IMS-JSI International Symposium on Immunology 2016, Pacifico Yokohama, Yokohama, JAPAN
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular Mechanism of Apoptotic Phosphatidylserine Exposure. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: The 2016 Gordon Research Conference on Cell Death, PGA Catalunya Business and Convention Centre, Girona, SPAIN
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Flippase and Scramblase that regulate phospholipid distribution at plasma membrane. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: 【Keynote address】The 26th International Complement Workshop, Hotel Nikko Kanazawa, Kanazawa, JAPAN
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: 【Keynote address】The 2016 CSI Congress on Immunology, Hefei Fengda International Hotel, Hefei, CHINA
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Apoptosis and exposure of phosphatidylserine. (2016)
  • Author(s): Nagata, S.
  • Organizer: The 30th Anniversary Symposium of IMB, Academia Sinica, Taipei, TAIWAN
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Exposure of Phosphatidylserine to the Cell Surface. (2016)
  • Author(s): 長田 重一
  • Organizer: 【特別講演】第68回日本細胞生物学会大会 京都テルサ 京都
  • Invited
• [Presentation] アポトーシスの分子機構の解明とその生理作用 (2016)
  • Author(s): 長田 重一
  • Organizer: 【特別シンポジウム】第75回日本癌学会学術総会 パシフィコ横浜 横浜
  • Invited
• [Presentation] 細胞膜の非対称性とその崩壊 (2016)
  • Author(s): 長田 重一
  • Organizer: 【特別講演】第66回日本薬学会近畿支部総会・大会 大阪薬科大学 大阪
  • Invited
• [Presentation] Structural analysis of a phospholipid scramblase (2016)
  • Author(s): 櫻木崇晴、長田重一
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会 沖縄コンベンションセンター 沖縄
• [Book] スクランブラーゼによるホスファチジルセリンの露出「実験医学」Vol.34, No.7(増刊), 68-73頁 (2016)
  • Author(s): 鈴木淳、長田重一
  • Total Pages: 205
  • Publisher: 羊土社
• [Book] リン脂質フリッパーゼとアポトーシス細胞の認識「実験医学」Vol.34, No.7(増刊), 74-80頁 (2016)
  • Author(s): 瀬川勝盛、長田重一
  • Total Pages: 205
  • Publisher: 羊土社
• [Remarks] 長田重一研究室
  • URL: http://biochemi.ifrec.osaka-u.ac.jp/