グルタミン酸輸送タンパク質PICK1を標的とした顎骨吸収抑制技術の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H06045
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 鎌野 優弥 東北大学, 大学病院, 助教 (70757260)
• Project Period (FY): 2015-08-28 – 2017-03-31
• Keywords: 骨芽細胞分化 / グルタミン酸レセプター / PICK1

Outline of Annual Research Achievements

MC3T3-E1細胞およびマウス骨髄由来間葉系幹細胞であるOricellを骨芽細胞分化誘導培地中で培養し、分化過程における細胞のトータルRNAを回収し、そこからcDNAを作製した。作製したcDNAを用いて、分化過程におけるPICK1遺伝子の発現を検討した結果、分化過程の前期から後期にかけてPICK1遺伝子の発現が確認された。このことから、PICK1遺伝子が骨芽細胞分化に何らかの影響を及ぼしていることが示唆される。
PICK1遺伝子を強制発現するベクターを構築するため、PICK1遺伝子のエントリーベクターを作製した。具体的には、mouse cNDAライブラリーを供与していただき、PCRにて増幅後目的のバンドを抽出し、TOPOクローニングによりエントリーベクターを構築した。さらに、構築したエントリーベクターをGateway cloning systemを応用することにより、レンチウイルスベクターに組み込んだ。構築したレンチウイルスベクターはPCRにてPICK1遺伝子が組み込まれていることを確認し、さらに制限酵素処理を行うことにより目的のPICK1遺伝子が組み込まれていることを確認した。このことから、必要なベクターの構築が完了したと考えられる。今後、HEK293A細胞に遺伝子導入し、Western blot assayにより、PICK1タンパク質の発現か可能であるかを検討する。PICK1タンパク質の発現が確認できれば、293FT細胞にレンチウイルスベクターを遺伝子導入し、PICK1を強制発現するレンチウイルスを作製する。作製したレンチウイルスを骨芽細胞に分化可能であるMC3T3-E1細胞およびOricellに感染させ、PICK1を強制発現する前駆骨芽細胞を作製する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の予定ではエントリーベクターを供与していただく予定であったが、cDNAライブラリーからエントリーベクターを作製する必要が生じたため、レンチウイルスベクターの構築に遅れが生じた。しかしながら、ベクターの構築は速やかに行えたため、その遅れは取り戻せる予定である。

Strategy for Future Research Activity

上記の通り、レンチウイルスベクターの構築にやや時間がかかったものの年度内に構築が完了した。また、PICK1遺伝子が骨芽細胞分化に影響を及ぼしていることが示唆されたため、今後レンチウイルスを用いて、PICK1遺伝子を強制発現する前駆骨芽細胞を構築することにより、骨芽細胞分化におけるPICK1の役割が明らかになると考えられる。具体的には骨芽細胞分化過程における遺伝子発現や骨芽細胞分化度を強制発現株とオリジナル株で比較することにより検討する。
さらに、PICK1の結合阻害剤であるFSC231を用いて、PICK1の機能を阻害することにより、更なる検討を行う。
骨芽細胞分化におけるPICK1の機能が明らかになったら、ラット頭蓋骨欠損モデルを用いて、生体外での機能が生体内で保存されているかを検討する予定である。