2016 Fiscal Year Annual Research Report
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15J00102
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森本 和志 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | PLA2 / EP3 / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ホスホリパーゼA2(PLA2)はリン脂質のsn-2位の脂肪酸を切断する酵素であり、様々な脂質群を基質とすることでアラキドン酸をはじめとする様々な脂肪酸およびリゾリン脂質を遊離する。PLA2の基質特異性は比較的緩やかであり、多様な基質を受容できる結合ポケットを持つことが推測される。
一方、PLA2によって産生された脂質群は代謝を受け、その一部はGタンパク質共役型受容体(GPCR)に作用することで作用を発揮する。例えばプロスタグランジン(PG)は計８種類のGPCRと結合することにより効果を発揮するが、EP受容体とDP受容体はケトン基(O)と水酸基(OH)の違いを見分けることが出来るほどその基質特異性は厳密である。
本研究では(1)sPLA2-ⅡD,ⅡF,Ⅴ,PNPLA1, PNPLA5および(2)PGE受容体EP3をモデルとし、合成酵素および受容体の両面から脂質シグナル分子の認識機構を明らかにすることを目的とする。
(1)PLA2について本年度はPNPLA1について、発現・精製の検討を行ったが、分解が激しく、十分な発現量を得ることができなかった。そこで種々のTruncation mutantを作製し発現量を上げることに成功したが、膜画分への吸着が強く、十分な収量を得ることは困難であった。
(2)昨年度までに昆虫細胞で発現したEP3受容体を精製することに成功していたが、収量および安定性が十分ではなかった。そこで本年度は、酵母による迅速なスクリーニング系を用い、さらにコンストラクトを改変することでこれらの改善を目指した。その結果得られた安定化変異体を用い、昆虫細胞5 L培養分から約3 mgのEP3受容体タンパク質を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PLA2の膜画分への吸着が強く、十分な収量を得ることができなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)PLA2については、界面活性剤で可溶化することにより収量の向上を目指す。
(2)EP3については結晶化および回折実験に取り組む。そこで十分な分解能が得られなかった場合には、コンストラクトの最適化に戻る。
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