牛白血病における病態発生機序の解析および新規制御法への応用

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J01886
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 西森 朝美 北海道大学, 獣医学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: 牛白血病ウイルス / 免疫抑制因子 / PD-L1 / 治療用抗体 / ウシ投与試験 / 抗ウイルス効果 / 大量培養系

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、牛白血病ウイルス（BLV）に対する新規制御法を開発するため、免疫抑制受容体Programmed death-1 (PD-1) およびそのリガンドであるPD-ligand 1 (PD-L1) を標的とした抗体を作製し、BLV感染牛を用いて抗ウイルス効果を評価する。今年度は、in vitroにおける抗体の機能解析とウシを用いた抗体投与試験を行った。
まず昨年度に樹立した抗体の安定発現細胞について、さらなる遺伝子増幅処理を行い、222.9 mg/Lの産生量を示す株を樹立した。この細胞は、より高産生に適した培地に順化することで738.1 mg/Lまで産生量を上昇させた。発現細胞から精製した抗体はウシPD-L1への結合能、PD-1/PD-L1の結合阻害能を示し、改変前のラット抗体と同等の性能を示した。さらに、ウシ末梢血単核球（PBMC）に対する免疫賦活効果を調べるため、PD-1/PD-L1経路を介してウシT細胞をin vitroで抑制する実験系を樹立し、作製した抗体がその抑制効果を減弱することを証明した。また、BLV感染牛のPBMCを抗原存在下で培養し、BLV抗原に対する応答が抗体の添加により上昇することも確認した。
作製した治療用抗体が改変前と同程度の活性を持つことが確認されたため、安定発現細胞から抗体の大量発現・精製を行い、ウシを用いた投与試験を行った。最初の投与試験は、体重が軽い子牛（200～300 kg）に1 mg/kgの濃度で抗体を投与し、経時的に採血してin vivoにおける抗ウイルス効果を評価した。抗体接種牛から分離したPBMCは接種前に比べBLV抗原に対して強く応答したほか、接種後のプロウイルス量が有意に減少することが示された。以上から、作製した治療用抗体はin vivoにおいても抗ウイルス効果を示すことが強く示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成28年度の研究計画では、抗体を高発現する安定発現細胞の樹立、in vitroにおける機能試験、およびウシを用いた抗体投与試験を予定していた。研究は当初の予定通りスムーズに進行しており、発現細胞の遺伝子増幅処理・至適培地への順化により昨年度の4倍以上の抗体産生量を実現したほか、新たに抗体の機能試験を行い治療用抗体の免疫賦活効果をより詳細に検討した。さらに、大量に発現・精製した抗体をBLV感染牛に投与し、抗原に対するT細胞応答やプロウイルス量を評価して、治療用抗体の抗ウイルス効果を確認した。現在は、さらに試験牛を増やして再現性を取ることを目的として、4～6頭分の投与抗体を準備中である。また今年度は、オーストラリアで開催された国際獣医免疫学会にてポスター発表を行い、さらに、BLV感染症の抗体治療および腫瘍解析に関する研究を論文にまとめ、それぞれPLoS OneおよびClinical and Vaccine Immunologyに筆頭著者として投稿するなど、研究成果の発表にも力を入れた。以上から、計画の進捗は順調であると評価している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、さらに高い抗体発現量を実現するため、至適培地への順化、培養条件の検討を複数の細胞株で行い、高発現細胞の樹立に努める。また、1～5 Lの細胞培養フラスコを用いて抗体の大量発現・精製を行い、成牛（600～800 kg）への投与試験、より高濃度（～10 mg/kg）での投与、および他剤との併用効果など、今回の再現性試験と抗ウイルス効果を高めるための条件検討を行う。また、BLV感染症に限らず他の慢性疾患を罹患したウシに対する治療効果を評価し、治療用抗体が幅広く効果を示すことを確認する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] シドニー大学(オーストラリア)
  • Country Name: AUSTRALIA
  • Counterpart Institution: シドニー大学
• [Int'l Joint Research] フィリピンカラバオセンター(フィリピン)
  • Country Name: PHILIPPINES
  • Counterpart Institution: フィリピンカラバオセンター
• [Int'l Joint Research] モンゴル生命科学大学(モンゴル)
  • Country Name: MONGOLIA
  • Counterpart Institution: モンゴル生命科学大学
• [Journal Article] In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection. (2017)
  • Author(s): Nishimori A, Konnai S, Okagawa T, Maekawa N, Ikebuchi R, Goto S, Sajiki Y, Suzuki Y, Kohara J, Ogasawara S, Kato Y, Murata S, Ohashi K.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 印刷中 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0174916
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Detection of bovine leukemia virus and identification of its genotype in Mongolian cattle. (2016)
  • Author(s): Ochirkhuu N, Konnai S, Odbileg R, Nishimori A, Okagawa T, Murata S, Ohashi K.
  • Journal Title: Archives of Virology Volume: 161 Pages: 985-991
  • DOI: 10.1007/s00705-015-2676-8.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Immunohistochemical Analysis of PD-L1 Expression in Canine Malignant Cancers and PD-1 Expression on Lymphocytes in Canine Oral Melanoma. (2016)
  • Author(s): Maekawa N, Konnai S, Okagawa T, Nishimori A, Ikebuchi R, Izumi Y, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Kato Y, Murata S, Ohashi K.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0157176.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] In vivo analysis of anti-bovine PD-L1 antibody for clinical application in BLV infection. (2016)
  • Author(s): Nishimori A, Konnai S, Okagawa, Maekawa N, Suzuki Y, Nakajima C, Kohara J, Kato Y, Murata S, Ohashi K.
  • Organizer: The 4th Sapporo Summer Seminar for One Health
  • Place of Presentation: 北海道札幌市北海道大学
  • Year and Date: 2016-09-20 – 2016-09-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Phenotypic analysis using flow cytometry provides novel character of B-cell lymphoma caused by bovine leukemia virus (BLV) in cattle. (2016)
  • Author(s): Nishimori A, Konnai S, Okagawa T, Maekawa N, Goto S, Murata S, Ohashi K.
  • Organizer: International Veterinary Immunology Symposium 2016
  • Place of Presentation: Gold Coast, Australia
  • Year and Date: 2016-08-16 – 2016-08-19
  • Int'l Joint Research
• [Patent(Industrial Property Rights)] PD-L1検出用抗PD-L1抗体 (2017)
  • Inventor(s): 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 岡川朋弘, 西森朝美, 他
  • Industrial Property Rights Holder: 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 岡川朋弘, 西森朝美, 他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2017- 61389
  • Filing Date: 2017-03-27
• [Patent(Industrial Property Rights)] 抗PD-L1抗体 (2016)
  • Inventor(s): 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Holder: 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2016-159088
  • Filing Date: 2016-08-15
• [Patent(Industrial Property Rights)] ウシ用抗PD-L1抗体 (2016)
  • Inventor(s): 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Holder: 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2016-159089
  • Filing Date: 2016-08-15
• [Patent(Industrial Property Rights)] 抗PD-1抗体 (2016)
  • Inventor(s): 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Holder: 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2016-159090
  • Filing Date: 2016-08-15
• [Patent(Industrial Property Rights)] 抗LAG-3抗体 (2016)
  • Inventor(s): 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Holder: 今内 覚, 大橋和彦, 村田史郎, 鈴木定彦, 中島千絵, 他
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2016-159091
  • Filing Date: 2016-08-15