ウイルス・卵菌類複合抵抗性遺伝子座ＲＣＹ１／ＲＰＰ８の転写後発現制御機構の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J01964
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 佐藤 有希代 東北大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: NB-LRRタンパク質 / 病害抵抗性遺伝子 / 植物ウイルス抵抗性 / キュウリモザイクウイルス / Cucumber mosaic virus

Outline of Annual Research Achievements

これまでに, キュウリモザイクウイルス黄斑系統 [CMV(Y)] 抵抗性遺伝子RCY1発現におけるイントロンのスプライシングは, RCY1タンパク質高蓄積およびCMV(Y)抵抗性の増強に必要であることを明らかにした. 本申請研究では, 植物においてRCY1タンパク質高蓄積およびRCY1を介したCMV(Y)抵抗性増強に関与する新たな因子の同定を目指している. イントロンを介したRCY1タンパク質蓄積増強はRCY1イントロン配列に依存しない. 一方, RCY1エキソンにシス配列が存在することを想定し, RCY1エキソンdeletionシリーズを用いて, イントロンを介したRCY1タンパク質蓄積量上昇に必要不可欠となる配列を探索した. この実験の結果, イントロンの存在に依存してRCY1タンパク質蓄積量を上昇させる特定のシス配列は存在しない可能性が高いことが考えられた. このため, 生化学的手法によりRCY1タンパク質蓄積増強に関与する因子を単離することは難しいと考え, 以降は遺伝学的スクリーニングによって同因子を探索している. RCY1トランスジーンを10コピー有するシロイヌナズナ系統Col::pRCY1-HA#13は, RCY1タンパク質の過剰蓄積により細胞レベルのCMV(Y)抵抗性を示す. 突然変異を誘発したCol::pRCY1-HA#13後代20000株にCMV(Y)を接種し, 組織レベルでウイルスが感染する変異株を選抜した. 現在までに独立変異株6系統を確立したほか, 候補株12系統を得た. 3系統について先行して詳細に表現型を解析しているが, いずれにおいてもRCY1転写産物量, RCY1タンパク質蓄積量がCol::pRCY1-HA#13系統に比べ1/10以下に減少していた. 現在この3系統においてRCY1転写産物量およびRCY1タンパク質蓄積量の激減を引き起こす原因変異のマッピングに着手している. 同原因変異を同定することで, 植物における抵抗性遺伝子を介した高度なウイルス抵抗性誘導に必要な因子を見出すことが期待される.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初, 生化学的手法によってイントロンを介したRCY1タンパク質蓄積増強機構に関与するRCY1相互作用因子を単離することを計画していたが, 同機構に必要なRCY1シス配列が特定の領域に存在しない可能性が高いことが考えられたため, 生化学的手法による同定は困難と考えた. そこで, 遺伝学的にRCY1蓄積およびCMV(Y)抵抗性増強に関与する因子をスクリーニングする実験を本格化した. 本年度夏に人工気象室の冷却機異常により, シロイヌナズナ数千個体が全て枯死し採種予定の種子が不活化するトラブルが発生したものの, 本年度末までには当初の計画通り, 遺伝学的スクリーニングによって本研究のねらいに合致する表現型を有する変異株を複数系統見出すことができた. 本年度は同変異系統の遺伝学的特性の解析のほか, 原因変異のマッピングにも着手している. 本年度は, 次年度にRCY1による抵抗性誘導に関わる新たな因子を同定しその機能を解明するための変異系統資源を確立するという, 今後の研究の発展につながる成果を得た.

Strategy for Future Research Activity

遺伝学的スクリーニングによりRCY1タンパク質蓄積およびCMV(Y)抵抗性増強に関与する新たな因子を同定する実験を引き続き進める. 具体的には, 突然変異誘発Col::pRCY1-HA#13後代で選抜した変異株の特徴づけ, 確立された変異系統における原因変異の同定およびCMV(Y)抵抗性減衰メカニズムの解析を同時に進行する. 原因変異の同定に当たり, (1) RCY1トランスジーン内部に原因変異が存在する場合と, (2) RCY1トランスジーン以外の遺伝子に原因変異が存在する2つの場合を想定し, 推進方策を考えている. RCY1遺伝子をもつ植物においてRCY1に機能喪失型の変異が生じた場合, CMV(Y)に対する抵抗性は喪失する. Col::pRCY1-HA#13においては, RCY1トランスジーンがゲノム上の複数の場所に10コピー挿入されており, 全てのRCY1トランスジーンに同時に機能喪失型変異が生じることは考えにくい. 一方で, あるRCY1トランスジーン内部にナンセンス変異が生じた場合に, 他の遺伝子座に挿入されたRCY1トランスジーンの発現に影響を与える可能性を想定している. その場合は, ナンセンス変異を有するRCY1と正常なRCY1の共発現実験によってこの可能性を検証し,生物学的意義について考察する. RCY1トランスジーン以外の遺伝子に原因変異が存在する場合は, 変異系統のCol::pRCY1-HA#13戻し交雑後代で変異系統と同等のCMV(Y)抵抗性減衰の表現型を有する個体集団を用いて, 次世代シークエンサーによる変異解析を行う. その後, 同定された原因変異を有する遺伝子の機能を逆遺伝学的, 生化学的に解析し, 抵抗性遺伝子を介したウイルス抵抗性誘導における役割を考察する.