2016 Fiscal Year Annual Research Report
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15J03760
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
中原 由揮 岡山大学, 環境生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | 植物 / アクアポリン / 二酸化炭素 / 酵母 / 膜タンパク質 / 植物生理学 / 分子生物学 / 電気生理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
二酸化炭素（CO2）は、植物の基本的な代謝である呼吸と光合成において重要な役割を果たす物質である。近年、主要作物であるイネにおいて、植物内外のCO2濃度や気孔におけるCO2輸送活性が、光合成の活性やバイオマス増産に深く寄与することが明らかとなった。しかし、イネにおけるCO2輸送体は未同定であるため、生体膜を介したCO2輸送のメカニズムは解明されていない。
本研究では、これまでにCO2を輸送することが報告されているアクアポリンという膜タンパク質に着目して、イネの持つ34種類のアクアポリンの中からCO2輸送活性を持つものを特定し、輸送機構を解明することを目的としている。本研究は、生物学的な価値にとどまらず、高バイオマスイネの開発につながるポテンシャルを持つ取り組みである。
昨年度は、酵母を用いた簡便なCO2輸送体スクリーニング法の開発やCO2輸送活性を持つイネアクアポリンの特定、植物アクアポリンのCO2輸送メカニズムの解明を進めた。
2年目に当たる平成28年度は、昨年度に引き続き、酵母CA株（炭酸脱水素酵素-EGFP融合タンパク質を恒常的に発現する出芽酵母株）を用いたCO2輸送体スクリーニング法の開発を進め、その中でCO2輸送活性を持つ可能性が高いことが明らかになったイネアクアポリンOsTIP2;2にフォーカスし、植物体内での局在解析などを行った。また、酵母内での各種アクアポリンの局在を調べ、その結果などを組み込んだ論文（H2O2輸送活性を持つオオムギアクアポリンHvPIP2;5に関する論文）を1報、副著で報告した。さらに、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いたCO2輸送活性測定法に使用する微小pH電極の作成方法について検討し、より感度の高い微小pH電極を安定して作成できる方法を考案した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、昨年明らかにすることができなかった“CA株にAtPIP1;2などのCO2輸送活性を持つアクアポリンを発現させた際に生じる生育阻害”の原因が、細胞内の酸性化によるものであったことを突き止め、CA株を用いた簡便なCO2輸送体スクリーニング法の開発を大きく進展させた。また、アミノ酸配列解析によって葉緑体包膜において発現していることが予想されるOsTIP2;2のイネ植物体内での局在を調査し、葉緑体包膜や葉緑体周辺の何らかのオルガネラにおいて発現していることを明らかにした。さらに、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いたCO2輸送活性測定法に用いる微小pH電極の作成方法について検討を行い、より感度の高く強靭な微小pH電極を安定して生産することのできる手法を確立した。
また、昨年行っていた酵母にイネ・オオムギ・シロイヌナズナのアクアポリンを発現させて酵母の細胞内局在を明らかにする実験で得られたデータや、オオムギアクアポリンHvPIP2;5とアミノ酸置換によって性質を変化させたHvPIP2;5ミュータントなどをH2O2感受性酵母（⊿skn7）に発現させて、H2O2ストレスに曝した実験の結果などを組み込んだ論文を1報、国際学術誌に副著として投稿し、掲載された。
しかし、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いたCO2輸送活性測定に用いる溶液の還流方法や装置に問題があることが発覚したため、今年度中に予定していたアフリカツメガエルの卵母細胞を用いた系でのイネアクアポリンのCO2輸送活性測定を行うことはできなかった。アクアポリンの発現量を変化させた形質転換イネの光合成活性を測定する実験も未だできておらず、主著の論文の投稿も今年度中に行うことができていないため、このような進捗状況区分で報告する。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究によって、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いたCO2輸送活性測定法に用いる微小pH電極は、安定的に高品質なものを準備できるようになった。今後は速やかに炭酸溶液などの還流方法の改善に取り組み、その上でイネアクアポリンのCO2輸送活性の測定を実施して、アクアポリンのCO2輸送の分子メカニズム解明を進めていく。そしてその中で、アクアポリンの水とCO2の輸送機構の違いやCO2を選択的に透過させるために重要なアミノ酸部位の特定を目指す。
また、昨年作成したOsTIP2;2形質転換イネの光合成活性を調べることで、OsTIP2;2が光合成に及ぼす影響や役割を明らかにしていく予定である。
今年度は研究最終年度に当たるので、これまでの研究によって得られた結果やこれからの実験で得られる成果をまとめ、論文を執筆して国際誌に投稿したり、国際会議などの場で発表を行ったりする予定である。
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