ミトコンドリア内膜トランスロケータＴＩＭ２３とＴＩＭ２２複合体の構造生物学的解析

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J05215
• Research Institution: Kyoto Sangyo University
• Principal Investigator: 松本 俊介 京都産業大学, 総合生命科学部, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: ミトコンドリア / トランスロケータ / TIM23複合体 / TM22複合体 / 結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリアタンパク質の99％は細胞質のリボソームで前駆体タンパク質として合成された後，ミトコンドリアの外膜及び内膜に存在するトランスロケータ（タンパク質からなる超分子複合体）によって外膜，内膜，膜間部そしてマトリクスのいずれかの区画に正しく輸送される．トランスロケータとしては，外膜にはTOM40複合体とSAM複合体，内膜にはTIM23複合体およびTIM22複合体そしてOXA複合体がある．特に，チャネルを構成する因子に関しては高分解能の構造情報がないため，ミトコンドリアタンパク質の膜透過や膜へのラテラルな組込みという最も重要な分子機構の解明が遅れている．本研究では，ミトコンドリア内膜に存在するTIM23複合体およびTIM22複合体のタンパク質膜透過チャネルについて，生化学的・分子遺伝学的解析による作動機構の解明と結晶構造決定を目指す．本年度の研究進捗状況としては，結晶構造解析に向けたミトコンドリア内膜チャネル構成因子の大量発現系を構築することが予想以上に難航しているため，進展が遅れている．Tim23については，大腸菌および出芽酵母での単独およびTim17との共発現を行ったが，Tim23の発現が確認出来なかった．一方で，Tim22については，大腸菌内に封入体を形成し，界面活性剤存在下での巻き戻しにより，精製することができたが，結晶化には成功していない．耐熱性酵母を用いたTIM23，TIM22複合体の精製系を確立させ，クライオ電子顕微鏡による単粒子解析により現状の打開を図る必要があるものと考えられる．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

結晶構造解析に向けてTim23，Tim17そしてTim22の大腸菌および出芽酵母を用いた大量発現を試みた．大腸菌を用いてTim23-Tim17複合体の共発現を行ったが，細胞膜および不溶性画分へのTim23-Tim17複合体の発現は確認できなかった．次に，様々な生物種由来のTim22を大腸菌で発現させたところ，どのTim22も細胞膜ではなく封入体を形成した．そこで，好熱性真菌Chaetomium thermophilum由来Tim22（CtTim22）について封入体から巻き戻しを行った．界面活性剤（DDM）存在下でCtTim22は，ゲルろ過でシングルピークとして溶出された．これまでに，蒸気拡散法およびLCP法を用いて，結晶化スクリーニングを行ってきたが，結晶は得られていない．出芽酵母のミトコンドリアへTim23-Tim17複合体のガラクトース誘導発現による過剰発現系の構築を試みた．しかしながら，Tim23-Tim17複合体を共発現させると，酵母の生育阻害が起こり，過剰発現ができなかった．

Strategy for Future Research Activity

クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によるTIM23およびTIM22複合体の構造解析を目指す．これまでの報告から出芽酵母由来から単離されたTIM23複合体およびTIM22複合体は，容易にサブユニットが解離する不安定性が構造解析を困難にしてきた．そこで，生育温度が最大50度という高温できる耐熱性酵母Kluyveromyces marxianusに着目した．本菌は，自律複製するプラスミドを用いた形質転換系は確立しているが，相同組換えによるゲノムへの遺伝子導入の効率は高くはない．そこで，ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いて，tim23およびtim22のC末端に精製用のアフィニティタグを導入したK. marxianus株の作製を試みている．