2016 Fiscal Year Annual Research Report
アフリカツメガエル卵成熟過程におけるアクチン－微小管相互ダイナミクスの分子機構
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15J05519
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
山岸 由佳 千葉大学, 融合科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | NPF / Arp2/3 complex / 卵成熟 / アクチンフィラメント / MTOC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度はアクチン-微小管クロスリンク因子の探索を行った。その結果、アクチンフィラメントの重合に寄与するArp2/3 complexのサブユニットが単離された。そのため本年度は、Arp2/3 complexの微小管への結合能を調査したが、特異的な結合は見られなかった。一方、二種の異なるArp2/3 complexのインヒビターを用いた実験から、Arp2/3 complexはアクチン重合とは異なる機構でMTOC-TMAのアライメントに影響を与える可能性が示唆された。そのため、Arp2/3 complexに結合する因子によって、微小管とアクチンがリンクされるという仮説を立て、Arp2/3 complexに結合するNPF (actin nucleation promoting factor)に着目した。NPFの中でも微小管に結合するドメインを持つことが報告されていたWASH（WASP and SCAR homologue）について解析を進めた。
WASHをノックダウンすると、MTOC-TMAの基部におけるアクチンフィラメントと微小管の局在にずれが生じた。続いて、WASH各ドメインの微小管へのアフィニティを確認したところ、過去の報告とは異なりVCAドメインが微小管と強く結合することが明らかになった。また、各ドメインを欠損させたWASH変異体を卵母細胞内で発現させた場合、WHDドメイン欠損型WASHは、細胞質におけるアクチン重合を引き起こした。しかし、全長のWASHの過剰発現ではこの影響は観察されなかった。以上のことより、WASHがVCAドメインを介してアクチン及び微小管のクロスリンクに関与し、またVCAドメイン依存のアクチン重合はWHDドメインによって制御されているという仮説を立て検証を進めている。本研究結果については、日本分子生物学会及びASCB（米国細胞生物学会）で公表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
アフリカツメガエル卵母細胞の卵成熟過程において、アクチンフィラメントは核内及び微小管系構造であるMTOC-TMA (microtubule organizing center and transient microtubule array) の基部に局在し、MTOC-TMAの形成及び極表層への移動を制御しているが、その詳細な分子機構は明らかになっていない。本研究の目的は、①卵成熟過程におけるアクチンフィラメント-微小管繊維間のクロスリンク因子を明らかにすること、②不透明な卵母細胞におけるライブイメージング系を確立し、卵成熟過程におけるアクチン-微小管ダイナミクスの相互依存的な制御機構を明かにすることである。
①については、現在までにArp2/3 complexの活性化に寄与するWASHが、卵成熟過程におけるアクチン-微小管クロスリンク因子として機能する可能性を見出している。また、WASHについては、アンチセンスヌクレオチド注入によるノックダウン時のMTOC-TMA構造の観察、各ドメイン欠損型WASHの高発現時の影響、WASH各ドメインのアクチン及び微小管に対してのin vitroにおける結合量の解析、ピレンアクチンによるアクチン重合速度への影響を観察しており、これらのデータは現在論文にまとめている最中である。よってクロスリンク因子の探索及び、その機能解析については順調に進行している。
一方、②のライブイメージング系の確立については、卵成熟進行途中にある卵母細胞をホスファチジルコリンを含むミネラルオイル中で内部を暴露させ、明視野で観察し、実験系の検討を行ってきた。しかしながら、当初の目標であるライブイメージング系の確立までは至っていない。以上のことから、イメージング系の確立については予定より遅れており、来年度はこちらを中心に研究を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ライブイメージング系の確立について：これまで、卵成熟過程におけるアクチン及び微小管の局在は、固定したサンプルによって観察してきた。しかし、相互依存的な制御機構を観察する上ではライブイメージングが欠かせない。よって、今後はライブイメージング系の確立を中心に実験を進めたい。現在までは予備実験として、核が壊れる過程をリン脂質を含むミネラルオイル存在下で、明視野によって観察してきた。しかし、核が壊れたか否かの情報が不十分であったため、今後は蛍光タグをつけた核膜マーカーを用い、蛍光顕微鏡によって、その条件が適切かどうかを判断する。すでにmCherryを付加し赤色蛍光で観察ができるようにしたLamin B及び、アクチンに結合するUtrophin、LifeactのmRNAを作成済みである。また、ミネラルオイル内のリン脂質の構成成分についても検討を重ねていく。更に、現在蛍光観察の際には、スライドガラス上にスペーサーを載せ、内部に卵母細胞を入れ、カバーガラスを載せて倒立型のコンフォーカル顕微鏡で観察をしている。しかしながら、スペーサー内部で卵母細胞が動いてしまい、統一した顕微鏡像が得られていない。そのため、スペーサーの高さや範囲を工夫し、卵母細胞が程良く固定された状態で観察できるようなチャンバーを作成する。また、実験系が確立し次第、作成済みのGFP-TubulinやGFP-actin、GFP-WASH、mCherry-UtrophinやLifeactを発現させ、卵成熟過程におけるアクチンフィラメント、微小管、及び両者の結合因子の動態を観察する予定である。
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Research Products
(2 results)
