2016 Fiscal Year Annual Research Report
オプトジェネティクスを用いたＭｕｓｅ細胞の分化メカニズムの解明
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15J05551
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
五十嵐 敬幸 東北大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | オプトジェネティクス / カルシウムシグナル / オルガネラ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、高い時空間分解能での細胞内カルシウムシグナル制御により、多能性幹細胞の活動依存的分化メカニズムの解明を目標としている。今年度は、細胞内カルシウムイオンダイナミクスの光操作を可能とする小胞体局在型チャネルロドプシン(ChRER)の解析を進めた。さらに、ChRERを単分化能を有するマウス筋細胞株(C2C12)に導入することで、小胞体からの周期的カルシウム放出が、収縮能の獲得に必須となるサルコメア形成を促進するとする仮説の検証を行った。
進捗①：カルシウムイオン透過性が高いとされるChR変異体(CatCh+)に小胞体係留シグナルを付加したCatCh+ERをC2C12に導入し、赤色カルシウム指示薬Rhod-FFを用いたリアルタイムCa2+イメージングを行った。光刺激と同期した赤色蛍光の増大を記録した結果から、CatCh+ERが小胞体に局在し、光刺激と同期した小胞体からのCa2+放出を誘起していることを確認した。
進捗②：小胞体からの周期的Ca2+放出が、収縮能の獲得に必須となるサルコメア形成に与える影響を解析するために、CatCh+ER-P2A-tdTomato陽性C2C12細胞集団に対して、分化10-12日目に慢性光刺激(1 Hz, 2時間)を与えた。光刺激終了後、免疫染色によってサルコメア構成因子であるfMHCの局在を可視化したところ、Sarcomere patternとPuncta-like patternの2種類が存在しており、光刺激を与えた集団ではPuncta-like なfMHCの局在を示す筋管細胞数が増加していた。このPuncta部位では部分的にサルコメア形成が進んでいた(第二回日本筋学会 ポスターと口演にて報告)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、小胞体局在型オプトジェネティクスツールの解析、そしてマウス筋芽細胞株C2C12を用いてサルコメア形成における細胞内Ca2+ダイナミクスの周期的変化がもたらす影響を調べた（研究室の代表的な研究成果として、第94回日本生理学会において口頭発表）。また、オプトジェネティクスやコネクトミクスなど、最先端の神経科学研究に資する新規トランスジェニックラット ４系統(寄託手続き中の系統を含む)を作製し、ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」( http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/nbr/Default_jp.aspx )を通じて世界中の研究者に提供している。これらの研究成果は、査読のあるオープンアクセス国際誌に筆頭・責任著者論文として１報受理され、さらに新規に１報を準備中である。国際学会で１件、国内学会で８件（うち口頭発表３件）発表を行ったことを含めて、研究の取り組みと成果が計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在は、マウス筋芽細胞株(C2C12)に小胞体局在型ChR(ChRER)を導入し、慢性光刺激を与えた際に確認された部分的なサルコメア形成の促進に関して、サルコメアの構成因子であるfMHCとChRERの局在の関係を調べている。この関係を明らかにし、小胞体局在型ChRの開発・解析からサルコメア形成におけるカルシウム仮説の検証をまとめて論文として報告する。
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| Remarks |
(1),(2)は筆頭・責任著者論文発表時のプレスリリース
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